中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志
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放射性骨丢失的多细胞调控机制

来源:CSOBMR 发布日期:2019-12-17 15:46:45浏览:2237次

作者:童玲 朱国英

单位:复旦大学放射医学研究所


摘要:放射性骨丢失是临床放疗常见并发症之一,主要表现为骨密度降低,骨折及骨转移发生率增加,不仅降低患者生活质量,给社会也带来沉重经济负担,已成为重要的公共卫生问题。然而,目前对放射性骨丢失的机制研究仍停留在早期水平,普遍认为电离辐射干扰成骨细胞和破骨细胞正常功能后引起的骨重建失衡是放射性骨丢失的重要机制,较少涉及骨组织及骨髓中的其他细胞群,包括骨细胞、血管内皮细胞及免疫细胞,这些细胞群的相互作用决定了骨重建失衡的发生发展。本文在前人研究的基础上重点从骨组织的多细胞水平阐述放射性骨丢失的机制,为临床放射性骨丢失防治提供重要理论依据。

关键词:放射性骨丢失;电离辐射;骨重建;多细胞调控;免疫细胞


放射性骨丢失作为肿瘤放射治疗后的重要并发症,不仅成为限制临床放疗预后的重要影响因素,而且其增加骨折及骨转移发生率,降低患者的生活质量,给家庭和社会带来沉重的经济负担。研究表明,宇航员航空飞行6个月后,骨盆和脊柱骨密度下降大于10%。动物实验证实,模拟空间环境X射线和微重力可引起大鼠骨丢失,卵巢切除大鼠经过14 d的航空飞行后松质骨面积也减少32%。此外,国外有大量关于放疗引起骨丢失的研究,如盆腔肿瘤患者放疗后骨盆骨折发生率达9.7%,乳腺癌患者放疗后自发性骨折发生率25.5%,周围型肺癌放射治疗患者肋骨骨折发生率高达34.1%,宫颈癌患者经放疗后骨密度也明显降低。而且,除了直接受照的靶组织或邻近组织,远离靶区的未受照骨骼也可能发生骨量丢失,表现为系统性骨丢失(systemic bone loss)。临床流行病学与动物实验研究已经证实,电离辐射致骨形成功能抑制及骨吸收功能活跃引起的骨重建失衡是放射性骨丢失的重要机理,但其确切机制尚未完全阐明。

放射性骨丢失的发生不仅与电离辐射直接引起细胞生物学功能的改变密切相关,骨重建的多细胞相互作用也促成了放射性骨丢失的发生发展,而且是系统性骨丢失的重要机制。成骨细胞(osteoblast,OB)和破骨细胞(osteoclast,OC)是骨重建的主要执行者,二者的生物学行为在时间和空间上有着密切的耦联。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell,BMSCs)经特定诱导可分化为OB,从而参与骨形成。骨细胞(osteocyte,OCY)为OB的终末阶段,又因其对OB及OC复杂的调节作用而被认为是骨重建调节器,所以受到人们广泛关注,同时也为放射性骨丢失的机制研究提供了新的方向。血管内皮细胞不仅参与骨血管形成,其为骨代谢提供精确的骨髓微环境,是维持骨稳态的重要物质基础。另外,免疫细胞对骨代谢也有十分复杂的调控作用。骨组织中的这些细胞既具有自己独特的功能,又通过细胞之间的相互作用组成复杂的多细胞调控网络,若物理、化学或生物因素引起其中一个环节出现紊乱,经过级联反应后,可能导致整个骨重建系统失衡。本研究重点从骨形成、骨吸收、骨血管及免疫细胞功能改变四个方面来阐述OB、OCY、BMSCs、OC、血管内皮细胞及免疫细胞等多细胞调控在放射性骨丢失发生发展中的作用。


电离辐射对骨形成功能的影响

骨形成主要包括两个阶段:OB合成分泌类骨质,类骨质经过矿化后形成骨基质。骨基质对维持骨骼的硬度及韧性有着重要意义。病理条件下,骨形成功能障碍引起骨密度降低,随着骨密度降低的持续进展,脆性骨折发生。


OB损伤

众所周知,OB具有一定辐射抵抗性,在动物水平的2 Gy电离辐射未引起OB损伤。体外研究显示,8 Gy电离辐射引起OB及其前体细胞株DNA损伤,抑制其增殖,细胞周期阻滞及凋亡增加,导致细胞大量衰老死亡。同时,6 Gy电离辐射抑制OB前体细胞株成骨向分化,并降低其活性,表现为辐射后OB成熟障碍,胶原蛋白合成不足,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性降低。动物研究同样证实,电离辐射后小鼠头盖骨中OB数量减少,股骨OB数量也明显减少,损伤的骨组织无法及时修复再生。综合考虑,8 Gy电离辐射引起OB数量减少,骨矿化障碍,从而导致骨密度降低。其机制可能与电离辐射通过氧化应激活化Nrf2/HO-1通路从而抑制OB的成熟和矿化有关。但是,电离辐射对OB及其前体的损伤作用能被甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)显著改善,其主要机制为PTH通过Wnt/β-catenin信号通路促进OB DNA损伤后的修复。PTH的促成骨作用已经被广泛证实,目前已用于临床治疗原发性和继发性骨质疏松。最新研究发现,蛋白酶抑制剂可通过抑制蛋白酶26S,促进OB DNA损伤后的修复,从而减轻电离辐射引起的骨丢失。此外,电离辐射不仅直接使OB DNA断裂,其产生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)对OB的矿化能力也有明显抑制作用,而且抗氧化剂能明显改善这些抑制作用


BMSCs损伤

BMSCs是一种多能干细胞,在特定诱导条件下可分化为OB、脂肪细胞、软骨细胞及成纤维细胞,同时BMSCs分泌多种细胞因子,是骨髓微环境的重要成分,参与调节骨髓中多种细胞的增殖分化及相互作用。骨损伤发生时,BMSCs动员至骨表面,在骨髓微环境诱导下分化为OB,发挥骨修复功能,其数量和功能的异常必定会导致骨修复障碍,骨代谢失衡。动物研究表明,单侧下肢10~20 Gy电离辐射抑制大鼠BMSCs成骨向分化,但促进其成脂分化。具体表现为照后BMSCs成脂能力增强,诱导矿化能力减弱,runt相关转录因子基因2(runt-related transcription factor 2,Runx2)与过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ)比值明显下降,ALP表达下调。而且该效应同时存在于直接受照侧及其对侧,其机制与辐射产生的ROS造成细胞脂质过氧化损伤有关。不仅大剂量电离辐射可抑制BMSCs的成骨向分化,低至2 Gy的电离辐射亦可引起BMSCs在照后7天出现细胞活力降低,ALP表达下降及体外矿化障碍。此外,细胞水平研究发现,10 Gy的电离辐射导致BMSCs DNA断裂,其衰老增加,克隆形成能力下降,胶原蛋白合成减少或降解加快,同时诱导矿化能力下降,标志基因Osx表达下调,而且此过程可能受P53基因调控。虽然电离辐射可抑制BMSCs的成骨向分化,但是国内有研究显示,黄芪多糖具有减轻辐射导致的BMSC细胞核、染色体、DNA损伤,降低BMSC微核率和染色体畸变率,促进BMSC增殖,并对BMSCs的成骨方向分化潜能具有保护作用;α2-巨球蛋白可通过增加BMSCs的抗氧化力,从而明显提高放射损伤后BMSCs的成骨向分化


电离辐射对骨吸收功能的影响

骨吸收是骨重建的重要环节,与骨形成处于动态平衡,共同维持骨的正常结构与功能。骨吸收的主要执行者为OC,由OC前体在OB及骨细胞等分泌的刺激因子下分化而来,迁移粘附至骨组织表面,产生一系列酸性酶清除损伤坏死的骨组织。电离辐射引起OC骨吸收功能活跃是放射性骨丢失的主要原因之一。此外,电离辐射引起的OC功能抑制导致骨微损伤累积,骨小梁强度降低,同样也增加了骨折发生率。

电离辐射对OC有双向调节作用。大量体内研究显示,低于2 Gy的电离辐射可促进OC生成。随着辐射剂量增加,OC的数目及功能仍然增加增强,但这种效应至多持续一周,其后迅速出现OC耗竭的现象。如给予大鼠单侧后肢5 Gy的照射即可引起OC数量改变,表现为先增高后逐渐耗竭,引起骨皮质逐渐增厚,骨质脆性增加。若辐射剂量增加至15~20 Gy,则OC耗竭期提前,甚至仅表现为OC数目持续减少。体外研究更加详细地解释了这些现象,低于1 Gy的电离辐射能促进OC的分化,主要表现为OC数目增加,而其活性增加并不明显。辐射剂量增加至1~2 Gy可促进OC融合,并上调其功能酶表达,使OC活性增强,若剂量持续增加,OC凋亡增加,OC数目则减少,但其功能酶表达仍然呈现上升趋势。因此,辐射对OC有双向调节作用,不仅表现在辐射早期OC活跃,随后OC耗竭,数目减少,而且还表现在低于2 Gy的辐射促进OC分化,增加其活性,4 Gy及以上的辐射促进OC凋亡,使OC数目减少,从而抑制骨吸收。另外,临床用于缓解骨转移癌疼痛使用的90Sr具有较强的亲骨性,可抑制破骨细胞的骨吸收功能,从而减轻肿瘤引起的骨组织损伤。电离辐射对破骨细胞的影响主要机制为电离辐射在细胞内产生大量ROS,其不仅是氧化应激产物,还作为第二信使激活NF-κB通路,促进OC分化,增强其骨吸收活性。电离辐射不仅对OC有直接作用,研究表明75 mGy的电离辐射通过调节BMSCs的细胞周期蛋白Rb, CDK1和CDC25B等,促进BMSCs增殖,并分泌更多干细胞因子(stem cell factor,SCF)、巨噬细胞粒细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和白细胞介素11(interleukin-11,IL-11),可能对OC活化起到间接作用。而且也有研究证实,电离辐射引起炎症因子分泌增加,OC分化加快,这一现象可被Sema3a(semaphorin 3A)阻断,从而发挥骨保护作用。此外,双磷酸盐可有效防止电离辐射致骨质疏松的发生,间接证明骨吸收活跃确实在辐射致骨损伤中发挥重要作用。抑制骨吸收也成为临床放射性骨丢失防治的重要方向。


电离辐射对骨细胞的影响

OCY是成熟骨组织中的主要细胞,不仅对骨组织起支撑作用,也是骨重建调节器,其胞体上丰富的小管突触结构能精确感受物理、化学或生物刺激,并将这些信号加工处理后传递给OB和OC,从而对骨形成和骨吸收进行多向调控。体内和体外研究发现,2~4 Gy的电离辐射即可使OCY凋亡增加,而且若将其与OC前体共培养并同时接受电离辐射干预,则分化形成的OC数目增加,且其骨吸收活性增强。电离辐射不仅直接导致OCY凋亡,OCY数目减少,使其对骨组织的支撑功能下降,衰老OCY还可分泌衰老细胞分泌的一系列细胞因子(senescence-associated pretory phenotype,SASP),将损伤信号进一步传递给OB和OC,通过相关通路进一步调节OB-OC平衡、降解骨基质、改变肿瘤转移微环境。其中的分子机制十分复杂,电离辐射产生的大量ROS不仅促进OCY凋亡,同时引起OCY促炎性因子、趋化因子和降解细胞外基质的蛋白等表达增高,如高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1),巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达上调,并通过JNK及ERK1/2通路使RANKL表达升高,从而引起OC活跃,骨吸收功能增强,还可能增加肿瘤骨转移的风险。此外,OCY在应力的作用下可促进乳腺癌细胞的迁移,并抑制其凋亡


电离辐射致骨血管损伤

血管为细胞提供氧气及各种营养,同时带走局部代谢产物,是细胞生存所必需。正常的血管结构是细胞、组织、器官发挥功能的物质基础。骨血管对维持骨骼的正常形态及功能十分重要,其结构及功能紊乱势必打破骨重建平衡,导致骨损伤。骨血管比较复杂,根据其内皮细胞CD31及内皮黏蛋白(endomucin,Emcn)表达量的高低,骨血管分为H型血管和L型血管。H型血管主要分布于干骺端,其血管内皮细胞高表达CD31及Emcn。L型血管主要分布于骨干,其血管内皮细胞低表达CD31及Emcn。相较于L型血管,H型血管与骨形成的关系更加密切,研究显示,BMSCs及OB等骨形成相关的细胞主要分布在H型血管附近

骨血管对电离辐射较为敏感。早在1926年,Ewing等报道,电离辐射可引起骨血管发生动脉内膜炎,血管闭塞。其后,Rohrer等也证实电离辐射可直接造成骨血管壁变薄并塌陷,管腔狭窄甚至闭塞,血管数目减少。其病理学机制为辐射引起血管内皮细胞及平滑肌细胞水肿坏死,胶原纤维变性,纤维素沉积,随着炎症的进一步发展,血管纤维化甚至闭塞。闭塞的骨血管造成骨营养不良,骨质疏松发生,可进一步发展为骨坏死。然而,如果将骨血管严格分类后进行研究发现,电离辐射并非造成所有骨血管减少,在辐射后7 d,虽然出现骨组织L型血管减少,但H型血管数目增加,说明在辐射诱导的条件下引发了H型血管的代偿作用,促进其对辐射损伤的骨血管进行修复并再生,而且H型血管的内皮细胞高表达血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF),转化生长因子(transforming growth factor,TGF)及成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)等多种生长因子对骨形成亦发挥重要调节作用。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)为血管内皮细胞前体,主要分布于骨髓,少量存在于外周血、肝脏、肾脏、心脏,在特定诱导条件下可分化为血管内皮细胞,参与血管新生与修复。在骨组织工程(tissue engineered bone,TEB)中,将内皮祖细胞和BMSCs共同移植至骨缺损处可促进骨损伤修复。此外,将同时附有内皮祖细胞和BMSCs的细胞膜片移植至辐射后的大鼠骨组织,可观察到其骨生成明显增加。因此,减少电离辐射致骨血管损伤,促进骨血管修复与再生可延缓放射性骨丢失的进展。另外,除了血管对骨代谢的调节作用,骨代谢产物又反作用于血管生成。研究表明,OB及骨细胞分泌的硬骨素(sclerostin,SO)具有与VEGF类似的促血管作用,表现为硬骨素作用后血管内皮细胞的增殖及血管生成增加。

血管与骨代谢的关系十分复杂,除了血管直接为骨组织提供营养并促进骨形成,血管内皮细胞对骨吸收也有重要调控作用。体外研究表明,2 Gy电离辐射即可抑制内皮祖细胞的血管生成,并下调其促血管生成因子VEGF-A的表达,与此同时,将其培养液上清作用于OC前体,观察到OC分化增加。另外,动物实验也同样证实,辐射作用后的小鼠骨血管可促进OC前体迁移并分化为OC,发挥骨吸收作用。这些研究证明,在电离辐射作用于机体的过程中,内皮祖细胞及血管内皮细胞对OC具有正向调控作用,而发挥调控作用的关键因子可能是基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1),趋化因子CX3C模体配体1(chemokine C-X3-C motif ligand 1,CX3CL1)。这些因子对OC前体产生趋化作用,使其迁移至辐射损伤区,其后分化为OC,清除损伤坏死的骨组织。


电离辐射致免疫细胞功能紊乱

骨髓中含有丰富的免疫细胞,免疫细胞对骨代谢有十分复杂的调控。免疫细胞是免疫系统的执行者,主要成员为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞及单核-巨噬细胞系统。正常生理条件下,B淋巴细胞对骨重建调节微弱,但出现病理情况如多发性骨肉瘤患者,其恶性B淋巴细胞产生的SO、DKK-1(dickkopf-1)及RANKL等因子,一方面抑制骨形成,另一方面促进骨吸收。T淋巴细胞和NK细胞激活后可分泌M-CSF及RANKL,是很多炎性疾病中OC活化的机制之一。此外,树突状细胞(endriticcell,DC)与OC关系十分密切,它不仅可以直接分化为OC,同时,其通过促进T淋巴细胞分泌RANKL可对OC的活性进行间接调节。另外,活化的巨噬细胞分泌的细胞因子抑瘤素M(oncostatinM,OSM)能促进BMSCs合成骨矿化基质,而且抑瘤素M不仅对骨形成有促进作用,其亦可促进OC生成。动物实验研究也显示,若将辐射后的大鼠淋巴细胞与BMSCs共培养,可观察到照后T淋巴细胞明显抑制BMSCs的ALP表达及矿化结节形成。因此,电离辐射致免疫细胞功能紊乱可能是放射性骨丢失的机制之一,而且其可能介导了放射性骨丢失的全身反应。


小结

电离辐射对骨骼和骨组织细胞效应特征与照射剂量相关,甚至在不同剂量时发生机理也不同。以往研究多采用2 Gy全身照射模型,其细胞学改变主要是照后早期的一过性OC活跃和BMSCs成脂分化增加,这也是临床采用双膦酸盐类等抑制OC活性、缓解骨疼痛的实验依据。但实体肿瘤是采用局部大剂量照射,可导致包括OC在内的细胞大量耗竭,其主要改变是OC凋亡引起的骨形成抑制而并不伴有明显的骨吸收活跃,而缺少OC参与的骨重建失衡会导致骨微损伤累积、基质脆性增加、小梁强度下降,骨折发生率也随之增加。因此,低于2 Gy的电离辐射引起的放射性骨丢失的治疗应以抑制骨吸收为主,辅以促骨形成及血管修复治疗,而8 Gy及以上电离辐射引起的骨损伤的治疗应该以促进骨形成为主,辅以促血管修复治疗。根据放射性骨丢失的机制研究,目前放射性骨丢失的治疗药物主要包括促进骨形成的PTH,抑制骨吸收的双磷酸盐类。另外,近年来有研究证明,SO引起的骨代谢紊乱可能是放射性骨丢失的机制之一,SO抗体通过激活Wnt/β-catenin信号通路可促进细胞DNA损伤后的修复,从而对OB及骨细胞发挥保护作用。活性维生素D可抑制减少骨髓中脂肪空泡形成,延缓电离辐射后骨丢失的发生发展。此外,辐射过程中产生的大量ROS是电离辐射致骨丢失及骨损伤的重要因素,联合抗氧化治疗也可能是治疗放射性骨丢失及骨损伤的新方向。除了药物治疗放射性骨丢失,有研究证明机械应力锻炼,包括游泳等,显著改善放射性骨丢失的症状

综上,放射性骨丢失的发生发展由多细胞调控,多因素影响,各细胞间相互作用、相互制约,建立了复杂的调控网络,本综述为临床放射性骨丢失防治提供重要理论依据。

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