作者：杨敏 黄凌云 吕泽平 陈晓 肖立伟

单位：

1、国家康复辅具研究中心附属康复医院内科

2、湖南省人民医院马王堆院区内分泌科

3、中南大学湘雅二医院口腔医学中心

摘要：目的 观察力学刺激对MG-63成骨样细胞护骨素(osteoprotegrin，OPG)表达及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路的影响，以及探讨MAPK信号通路在OPG表达中的作用。方法 将不同作用时间的机械应变分别作用于MG-63成骨样细胞，采用免疫印迹(Western blot)法检测OPG蛋白、磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)、p38MAPK(p-p38MAPK)、JNK(p-JNK)表达，采用RT-PCR方法检测OPG mRNA的表达，同时应用信号通路阻断剂观察MAPK各信号通路在OPG表达中的作用。结果 机械力学刺激明显促进了MG-63成骨样细胞OPG蛋白及mRNA的表达，加力1、3、6、12 h后OPG蛋白表达分别是对照组的2.3、4.2、5.9、6.6倍(P＜0.05)，加力3、6、12 h后OPG mRNA表达分别是对照组的4.8、6.8、7.5倍(P＜0.05)，加力12 h组作用最明显。力学刺激能够激活ERK1/2信号通路，加力60 min后激活最显著，p-ERK1/2表达是对照组的3.2倍(P＜0.05)。力学刺激也能激活JNK信号通路，加力10 min后开始活化，加力30 min后最显著，加力10、15、30 min后p-JNK表达分别是对照组的2.9、4.3、5.1倍(P＜0.05)。但力学刺激不能激活p38MAPK信号通路。分别应用ERK1/2、JNK的信号通路阻断剂后，发现当抑制ERK1/2信号通路时，OPG蛋白表达也受到了抑制，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 机械力学刺激上调了MG-63成骨样细胞OPG蛋白及mRNA的表达，ERK1/2信号通路可能参与了此过程。

关键词：力学刺激；成骨细胞；护骨素；MAPK信号通

机械力学刺激是维持骨细胞活性的重要调节因子，能够调节成骨细胞的增生、分化及凋亡，促进骨形成。在没有力刺激或负重降低的情况下如长期卧床、航天飞行(失重状态)等均可引起骨密度(bone mineral density，BMD)及骨超微结构改变，从而导致骨丢失及骨质疏松的发生。在骨组织中，骨细胞及成骨细胞是能够感受外来机械力学刺激，并对此做出应答反应的主要成员。既然力学刺激能够促进成骨细胞的增生分化，那么成骨细胞是如何把力学刺激信号转换为生物化学信号而发生应答效应的呢？虽然研究较多，但具体机制仍不清楚。本研究采用四点弯曲原理设计的细胞加力装置，观察周期性的力学刺激对MG-63成骨样细胞护骨素(osteoprotegrin，OPG)的表达及MAPK信号通路的影响，以及探讨MAPK信号通路在OPG表达中的作用。

材料与方法

材料与试剂

DMEM培养液、Trizol、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国Gibco公司；反转录试剂盒(Revert Aid TM First-Strand cDNA Synthesis kit)购于美国Fermentas公司；人成骨肉瘤MG-63细胞株购自美国培养物保存中心(ATCC号：CRL1427)；抗CTGF、ERK1/2、p-ERK(1/2)、p38MAKP、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK及抗羊、抗小鼠、抗兔HRP标记的二抗均购自Santa Cruz公司。抗小鼠β-actin抗体购自美国Sigma公司。ERK1/2信号通路的阻断剂PD98059、p38MAPK信号通路的阻断剂SB203580、JNK信号通路的阻断剂SP600125及PI3K信号通路阻断剂LY294002购自Calbiochem公司。

方法

细胞培养：人成骨肉瘤MG-63细胞培养用DMEM培养液(内含10% FBS、50 μg/mL抗坏血酸、100 U/mL青霉素、100 μg/mL庆大霉素)培养，每3天换液1次，细胞达汇片后用0.25%胰酶-EDTA消化，按104/cm2密度接种至细胞加力板上。培养48~72h后，进行力学刺激。

干预实验：干预前换无血清含1% BSA的DMEM培养基饥饿24 h，并于干预前1 h加入信号通路阻断剂(50 μmol/L PD98059、30 μmol/L SP600125)，然后进行力学刺激3 h，对照组加入DMSO。采用根据四点弯曲原理设计的细胞加力装置对成骨细胞进行力学刺激，该装置已获2项国家专利(专利号01129166.4及ZL01256849.X)。该装置工作时，细胞加力板发生弯曲变形，因而附着在表面的细胞受力而发生形变。根据受力情况分为对照组及加力组(2 000 μstrain，0.2 Hz)。

RT-PCR法检测：各组弃去培养液，用Trizol按操作说明方法提取细胞总RNA，反转录成cDNA产物，保存于-4 ℃。引物通过PCR Designer软件设计，OPG引物序列：上游引物5′-AACCCCAGAGCGAAATAC-3′；下游引物：5′-AAGAATGCCTCCTCACAC-3′，退火温度是57 ℃，产物片段为219 bp，反应30个循环。ACTIN引物序列：上游引物5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′；下游引物：5′-CAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3′，退火温度是57 ℃，产物片段为115 bp，反应25个循环产物。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳。电泳产物经紫外透射反射分析仪分析，比较各组条带的平均密度值，并以ACTIN的平均密度值校正，以两者比值表示mRNA相对表达量。

Western blot法检测：检测OPG、p-ERK1/2、p-p38MAPK、p-JNK蛋白表达水平。按照蛋白抽提试剂盒操作要求抽提总细胞蛋白，测蛋白浓度，取50 μg细胞总蛋白在SDS-PAGE胶中进行电泳。电泳后进行转膜，将胶上蛋白转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h，PBS冲洗3遍。一抗4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3遍，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，PBS冲洗3遍，最后显影洗片。用Image Master VDS成像分析系统行吸光度检测。

统计学方法

采用SPSS17.0统计软件处理实验数据，所有结果均以均数±标准差(x±s)表示，组间比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

机械力学刺激对MG-63成骨样细胞OPG蛋白及mRNA表达的影响

Western blot法及RT-PCR检测结果显示，机械力学刺激明显促进了MG-63成骨样细胞OPG蛋白及mRNA的表达，并且呈时间依赖性增加，加力1、3、6及12 h后OPG蛋白表达均明显增加，与对照组(无力学刺激组)相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。加力3、6、12 h后OPG mRNA的表达明显增加，与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)(图 1)。

机械力学刺激对MG-63成骨样细胞MAPK信号通路的影响

力学刺激可以激活ERK1/2信号通路，10 min开始活化，15 min时又下降到基础水平，继而在30及60 min持续活化，至60 min达到顶峰。力学刺激也可以激活JNK通路，10 min开始活化，15~30 min达高峰，但到60 min降到基础水平。力学刺激不能激活p38MAPK信号通路(图 2~4)。

ERK1/2及JNK信号通路阻断剂对力学刺激诱导的MG-63成骨样细胞OPG蛋白表达的影响

应用ERK1/2、JNK信号通路阻断剂后，观察力学刺激对OPG蛋白表达的作用, 发现ERK1/2信号通路阻断剂PD98059阻断了力学刺激对OPG蛋白表达的上调作用。但是JNK信号通路阻断剂SP600125不能阻断这一作用(图 5, 6)。

讨论

骨代谢包括骨形成与骨吸收，两者要维持动态平衡，一旦平衡被打破，破骨细胞功能亢进，骨吸收超过骨形成，就会导致OP的发生。力学刺激是维持BMD和骨超微结构的重要作用因子，能够使骨骼维持最佳的力学特性，在骨重建以及骨折修复等过程中发挥着重要作用。机械力学刺激的大小、频率以及作用方式的不同，对成骨细胞及破骨细胞功能的影响也是不同的。一般认为，在生理强度范围力学刺激可以促进成骨细胞增生分化，增加骨量；相反，超生理强度范围内力学刺激，则会降低骨量。本研究采用了研究学者广泛应用的四点弯曲细胞力学刺激装置，并且早期研究发现，机械应变值为2 000 μstrain，频率为0.2 Hz是较适宜的力刺激强度，能够明显促进成骨细胞的增生。因而本研究将力的频率设定为0.2 Hz，机械应变值设定为2 000 μstrain。近年来许多研究探讨了机械力学刺激在OP中的作用，但作用机制仍不明确。本研究观察了力学刺激对成骨样细胞OPG表达及MAPK信号传导通路的影响。

OPG是一种可溶性分泌蛋白，成骨细胞及骨髓基质细胞均可表达分泌。研究表明，OPG主要生理功能是与细胞核因子-κB受体活化因子(nuclear factor-kappa B receptor activating factor，RANK)竞争性结合细胞核因子-κB受体活化因子配体(nuclear factor-kappa B receptor activating factor ligand，RANKL)，防止RANKL与RANK结合过多造成的破骨细胞过度活化，以及抑制前体破骨细胞分化、活化及诱导成熟的破骨细胞的凋亡。破骨细胞虽受多种激素和细胞因子调节，而最终效应因子是OPG系统。在很大程度上，骨形成与骨吸收的动态平衡靠可溶性OPG表达调节。Simonet等发现OPG能明显抑制破骨细胞的形成，并引起BMD升高。本研究发现，与对照组相比，加力组OPG蛋白及mRNA的表达均明显升高，并呈时间依赖性增加，这与许多研究结果一致。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated pro-tein kinase，MAPK)信号通路是细胞内最重要的信号通路之一，能将多种细胞外刺激产生的信号从细胞膜传递到细胞核内，参与介导细胞增生、分化等多种病理生理过程。MAPK信号系统主要包括细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、c-Jun N末端激酶(c-Jun-NH2-terminal kinase，JNK)以及p38MAPK，且其磷酸化水平的高低反映了它们的活化程度。近来研究发现，MAPK信号通路在力学刺激诱导的成骨细胞增生分化中发挥重要作用。尤其是ERK1/2信号通路被发现在成骨细胞的多种生理功能过程中起作用。Schmid等发现周期性的机械牵张力能够引起成纤维细胞胶原蛋白基因转录及合成，ERK1/2信号通路早期即被活化并当牵张力增加时再次被激活。那么MAPK信号通路是否也参与了力学刺激引起的成骨细胞OPG的表达，目前国内外研究尚不多见。

本研究发现，力学刺激激活了ERK1/2及JNK信号通路，但对p38信号通路没有影响。ERK1/2活化持续时间较长，从10 min开始活化，于15 min时降至基础水平，30~60 min持续活化，并在60 min时到达高峰。而JNK活化时间短暂，15~30 min达高峰，60 min时基本降到基础水平。笔者推测这可能与ERK、JNK信号通路的特点有关。有研究表明，ERK1/2可以通过反馈调控增加(正反馈)或者减弱(负反馈)ERK活性，从而实现对ERK信号强度和持续时间的控制。因而推测ERK1/2 10 min开始活化后15 min降至基础水平，可能与暂时的负反馈调节有关系，但具体机制不明。同时也有研究表明，JNK的适度、暂时活化，引起细胞增生，而剧烈、持续活化则引起细胞死亡，推测JNK的活化持续时间，可能与细胞外刺激的形式、强度、持续时间等有关系，适宜的细胞外刺激可能引起JNK的短暂活化。本研究发现ERK1/2或JNK可能参与了力学刺激诱导的成骨细胞OPG蛋白的表达，因而用ERK1/2信号通路特异性阻断剂PD98059阻断ERK1/2的活化，结果发现，PD98059阻断了力学刺激引起的ERK1/2的活化，并抑制了力学刺激诱导的OPG的蛋白表达；而本研究用JNK信号通路特异性阻断剂SP600125时发现，SP600125阻断了力学刺激引起的JNK的活化，但对力学刺激诱导的OPG的蛋白表达没有影响。本研究结果表明，机械力学刺激可能通过激活ERK1/2信号通路，引起了MG-63成骨样细胞OPG的表达，而JNK及p38MAPK信号通路没有参与这一过程。因而推测力学刺激可能通过激活ERK1/2信号通路上调了OPG的表达，竞争性地阻断了部分RANKL与RANK的结合，抑制了破骨细胞活化，抑制了骨吸收，从而发挥抗OP的作用。