作者：李凯 高玉海 王玺 侯雪峰 陈克明

单位：中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院骨科研究所

摘要：目的 探讨葛根素对尾吊大鼠发生废用性骨质疏松模型的防治作用。方法 将30只2月龄Wistar雌性大鼠采用数字表法随机分为3组:对照组(Control组，n =10)、尾吊组(HLS组，n =10)、尾吊+葛根素组(HLS+Pur组，n =10)。HLS+Pur组给予15.4 mg/(kg·d)葛根素配制成的混悬液灌胃，Control组和HLS组灌同等体积的蒸馏水，每周测1次体质量，根据体质量调整灌胃剂量。4周后腹主动脉采血处死，检测大鼠离体左侧股骨骨密度(bone mineral density，BMD)和椎骨BMD、骨生物力学和骨形态计量学参数、血清骨代谢生化指标改变。结果 与Control组相比，HLS组股骨(0.110±0.002)、椎骨离体BMD(0.124±0.004)，骨生物力学参数均下降，差异有统计学意义(P < 0.01)，骨形态计量学参数中，标记后荧光间距明显较小(32.790±6.698)，VG(Van.Gieson法)色示骨小梁数目减少(2.873±0.353)、骨小梁厚度变薄(70.604±4.012)、骨小梁分离度变大(433.493±26.047)，差异均有统计学意义(P < 0.01)。此外，血清骨形成指标1型前胶原氨基末端肽(procollagen 1 N-terminal peptide，P1NP)含量降低(166.259±66.065)(P < 0.05)，骨吸收指标1型胶原C端肽(collagn 1 C-terminal peptide，CTX-1)含量增加(61.805±19.930)(P < 0.01)；与HLS组相比，HLS+Pur组股骨BMD(0.117±0.004)、椎骨BMD(0.131±0.003)、骨生物力学、骨形态计量学均有不同程度改善(P < 0.01)。结论 葛根素对尾吊大鼠发生废用性骨质疏松具有良好的防治作用，可为开发葛根类抗废用性骨质疏松药物奠定基础。

关键词：葛根素；尾吊大鼠；废用性骨质疏松

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种全身性骨骼疾病，其特征在于骨量低和微观结构的破坏，且容易发生骨折。废用性骨质疏松症(disuse osteoporosis，DOP)属继发性OP的一种，是由于机械应力刺激减少而引起局部或全身骨量丢失所致的OP。近年来因各种老年性疾病、突发状况而长期卧床所导致的骨功能失用，以及宇航员DOP的高发生率，已引起了重视。目前防治DOP药物价格普遍比较昂贵，治疗效果不持久且不良反应较大。因此，寻找价格便宜、治疗效果持久且不良反应小的药物很有必要。

葛根作为传统中医药，在我国具有分布广泛，价格低廉的优势，其主要成分是葛根素，葛根素属于异黄酮类化合物，具有雌激素样活性，与具有抗OP作用的大豆异黄酮在化学结构上相似。有文献报道葛根素能通过促进成骨细胞分化和增生、抑制骨吸收调控骨代谢。研究发现其在去卵巢雌性大鼠、老龄化以及糖皮质激素等诱导的OP模型中抗OP效果稳定。本实验以大鼠尾吊模型即后肢悬浮模型为DOP模型，探讨葛根素防治尾吊大鼠发生DOP的效果，对于探究中医药发挥防治OP效果以及开发葛根类新药有重要的意义。

材料与方法

仪器与试剂

双能X线骨密度仪(Prodigy，GE公司，美国)，AG-X系列台式电子万能试验机(岛津公司，日本)，硬组织切片机(SP1600，LEICA公司，德国)，酶标仪(BioTeK公司，美国)，BX53型正置显微镜(奥林巴斯公司，日本)，4A型数显多头磁力恒温搅拌器(金坛区西城新瑞仪器厂)，水合氯醛(天津大茂化学试剂公司，中国)，ELISA骨形成指标P1NP试剂盒(IDS公司，英国)，ELISA骨吸收指标CTX-1试剂盒(IDS公司，英国)。

药品

葛根素购自于宝鸡市辰光生物科技有限公司，批号：20160711，由豆科植物野葛干燥根中提取，分离得到的8-β-D-葡萄吡喃糖-4′，7-二羟基异黄酮，化学式为C₂₁H₂₀O₉，具有抗氧化、改善微循环等多种药理活性，本品呈干燥白色结晶性粉末，贮存2~8 ℃，纯度>98%。

实验动物

2月龄Wistar雌性大鼠30只，体质量160~180 g，购自甘肃中医药大学实验动物中心, 实验动物许可证号:SCXK(甘)2015-0002，在SPF级实验中心动物房饲养，饮食、饮水无限制。

分组

将实验动物采用数字表法进行完全随机化分组：对照组(Control组)，尾吊组(HLS组)，尾吊+葛根素组(HLS+Pur组)，每组10只。

尾吊造模

用75%乙醇涂搽大鼠尾巴的表面，去除不洁净的油脂和皮屑，防止感染。将大小适中的医用透气橡皮膏粘贴于需尾吊大鼠远离尾尖部4~5 cm处，附着上制作好的钢丝环，加绕橡皮膏2~3圈固定。尾吊笼子里面的钢环挂钩和钢丝环锁定在一起，通过调节锁链的长短，保持大鼠头低尾高，身体纵轴倾斜与水平轴呈30°左右的夹角，此夹角是尾吊比较适宜的角度，使大鼠的双后肢在伸直状态下与笼子底部半分离，不能自由活动，前肢着地可自由活动和饮食饮水，即大鼠整体处于废用性状态。

配药及给药

将葛根素粉末少量多次倒入研钵中，一边加蒸馏水一边反复研磨，使葛根素能够充分的溶解于蒸馏水中，配制成1.54 g/L的混悬液，HLS+Pur组以每只大鼠15.4 mg/(kg·d)给药，Control组和HLS组灌同等体积的蒸馏水，每周测一次体质量，根据体质量调整给药剂量。葛根素剂量来源于前期课题组葸慧荣等验证应用的有效葛根素给药剂量，即15.4 mg/(kg·d)。

组织病理学检测

剥离实验大鼠的肝、脾、肺、肾、肾上腺等脏器，使用甲醛溶液浸泡固定，经石蜡包埋HE染色，显微镜下观察组织病理学结果。

骨密度测定

实验大鼠干预4周后，水合氯醛腹腔麻醉，采用腹主动脉采血处死，剥离大鼠的股骨、椎骨，用0.9%氯化钠注射液浸润过的纱布包裹冻存于-20 ℃冰箱，骨密度(bone mineral density，BMD)测定时，自然解冻，置于双能X线BMD检测仪下，检测左侧股骨和椎骨的BMD。

骨生物力学测定

将检测完离体BMD的左侧股骨，放于AG-X生物力学万能机上，以跨距15 mm，加载速度10 mm/min进行三点弯曲实验，记录最大载荷和弹性模量，改换压缩模具，第5腰椎(L5)用砂纸反复打磨至两头平滑之后，置于万能机的不锈钢平台上，以2 mm/min的速度持续行进施加压力，记录最大载荷和弹性模量。

血清生化指标检测

用动脉取血法抽取大鼠血样，5 000 r/min离心15 min，将上层血清冻存于-80℃的冰箱，ELISA试剂盒测定骨形成指标P1NP和骨吸收指标CTX-1，于酶标仪在450 nm检测并运用标准曲线计算出样品中含量，单位为μg/L，试剂盒均来自于IDS公司。酶标仪检测血清的长期变异系数(coefficient of vatiation, CV)为 < ±0.15%，注液精度CV为≤2%(每孔注液300 μL时)。

骨形态计量学检测

在实验进行到13、14 d时，以30 mg/kg剂量给予颈部皮下注射盐酸四环素；23、24 d时，以8 mg/kg剂量给予颈部皮下注射钙黄绿素。分离出的左侧胫骨固定后，经70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇，正丁醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各两小时，1号试剂(甲基丙烯酸甲酯200 mL，邻苯二甲酸二丁酯50 mL，二甲苯250 mL)、2号试剂(甲基丙烯酸甲酯400 mL，邻苯二甲酸二丁酯100 mL)、3号试剂(甲基丙烯酸甲酯400 mL，过氧化苯乙酰10 g在37 ℃烘箱干燥24 h，邻苯二甲酸二丁酯100 mL)各5 d脱水浸泡，4号试剂(甲基丙烯酸甲酯400 mL，过氧化苯乙酰30 g在37 ℃烘箱干燥24 h，邻苯二甲酸二丁酯100 mL)60 ℃水浴凝固不脱钙塑料包埋法进行包埋，包埋体置于SP1 600硬组织切片机切片，厚度为610 μm，每个标本切取两张，用1200目的砂纸打磨成形，1500目砂纸精细打磨至几乎与塑脂载玻片同一水平线，一张镜下观察荧光标记及进行荧光量化，另一张经过VG染色，显微镜下观察染色结果，并采用IPP6.0软件进行量化分析。1~4号试剂均需磁力珠搅拌12 h充分混合所配成。

统计学方法

采用SPSS21.0软件进行数据统计分析，用均值±标准差(x±s)表示，不同组间差异用单因素方差分析，符合正态分布且方差齐性用LSD，不符合方差齐性用Games-Howell，进行两两比较，P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

组织病理学检测

病理学镜下观察发现各脏器均未表现出明显损伤，尾吊模型对脏器损伤较小，实验所采用的葛根素剂量对大鼠组织无不良损伤，无任何不良反应(图 1)。

BMD检测结果

与对照组相比，HLS组左侧股骨和椎骨的离体BMD均明显降低(P < 0.01)；与HLS组相比，HLS+Pur组左侧股骨和椎骨的离体BMD均有不同程度升高(P < 0.01)(图 2)。

骨生物力学检测结果

与对照组相比，HLS组左侧股骨和椎骨的最大载荷和弹性模量均显著下降(P < 0.01)；与HLS组相比，HLS+Pur组左侧股骨和椎骨的最大载荷和弹性模量均有上升(P < 0.01)(图 3)。

血清生化指标检测结果

与对照组相比，HLS组骨形成指标P1NP含量显著减少(P < 0.05)，骨吸收指标CTX-1含量显著增加(P < 0.01)；与HLS组相比，HLS+Pur组骨形成指标P1NP含量有显著增加(P < 0.01)、骨吸收指标CTX-1含量显著减少(P < 0.01)(图 4)。

荧光标记结果

在20倍物镜下，可见不同组荧光素之间的距离存在差距(图 5)。与对照组相比，HLS组四环素与钙黄绿素之间的距离显著变小(P < 0.01)，而HLS+Pur组四环素与钙黄绿素之间的距离较HLS组显著变大(P < 0.01)(图 6)。

VG染色结果

在4倍物镜下，可见尾吊之后骨小梁比较稀疏，与对照组相比，HLS组的骨小梁数目明显减少、骨小梁的厚度明显变薄、骨小梁分离度明显变大，差异均有统计学意义(P < 0.01)(图 7)；而对于葛根素灌胃防治组，骨微结构得到了一定改善，与HLS组相比，HLS+Pur组的骨小梁数目明显增加、骨小梁厚度增加、骨小梁分离度明显变小，差异均有统计学意义(P < 0.01)(图 8)。

讨论

我国人口老龄化进程的加速、交通事故的意外频发导致逐年增长的DOP发病率已经严重危害了人民的身体健康，而载人航天时宇航员的失重等也可引起DOP，阻碍了我国航天事业的步伐。中医药治疗DOP有着悠久的历史和丰富的经验，越来越得到国内外各界的关注。

中医学中无“废用性骨质疏松”病名，根据其病因病机以及症状，可归属于“骨痿”的范畴。此前，中医临床上常采用具有补肝肾、强筋骨的淫羊藿、骨碎补、菟丝子、蛇床子以及活血化瘀的丹参等药物治疗。葛根甘、辛、凉，归脾胃经，具有解肌退热、透疹、生津止渴、升阳止泻等功效，常被用于颈椎病和心脑血管病的治疗。葛根素作为葛根的主要活性成分，现代药理学研究认为其在抵抗心率失常、降血压、保护心肌结构、扩张脑血管、改善微循环、降血糖等多方面都有效果。近年来研究发现葛根素对多种OP有非常好的防治作用，其在预防与治疗DOP方面的作用尚未见报道。本实验初步探究并明确其对DOP模型的防治作用及其机制。

尾吊模型由美国宇航局建立并经Wronski等提出和发展，能很好地模拟因患者卧床和航天员失重等引发的DOP。BMD作为OP的诊断标准，早在1994年已经被世界卫生组织(World Health Organization，WHO)所采纳。

BMD越低、骨强度越弱，越容易发生骨折。本实验大鼠尾吊4周以后，与对照组相比，显示股骨和椎骨的BMD明显降低，而经葛根素灌胃后，BMD显著上升，骨量明显增加，表明葛根素可能通过提高BMD预防OP。骨生物力学和骨形态计量学是检测骨质量的重要指标，骨生物力学能够准确测量骨受力与骨韧性的表现情况，骨受力越弱弹性模量越小、OP发生可能性越高。骨形态计量学作为骨微观的反映，能够确切描述骨小梁的情况，骨小梁数目越少、厚度越薄、分离度越大，证明骨质越稀疏。尾吊模型大鼠应用葛根素以后，骨受力明显变大，骨韧性明显上升，骨小梁数目也显著增加，骨小梁厚度明显增加、分离度明显变小，骨骼的机械强度增加且骨微结构得到改善，表明葛根素可以通过提高骨生物力学指标和改善骨形态计量学参数，防治DOP的发生。血清生化指标能客观测定骨形成和骨吸收状态，从本研究血清生化指标的改变可以看出，葛根素防治组P1NP含量活性显著增加，CTX-1活性含量显著减少，葛根素促进了骨形成因子的表达、降低了骨吸收因子的表达，揭示葛根素同时参与了骨形成和骨吸收过程，能促进骨形成、抑制骨吸收。

综上所述，葛根素可以通过提高BMD，提升骨生物力学参数和改善骨微结构，并参与骨形成和骨吸收，对尾吊大鼠发生DOP起到良好的防治作用，为葛根素进一步应用于临床提供了依据。