作者：肖启程¹ 严光文² 田一男¹ 魏斌¹ 涂蕊¹ 但佳明¹ 彭广能¹ 王玉飞³ 钟志军¹

单位：

1、四川农业大学动物医学院 动物疫病与人类健康四川省重点实验室

2、西昌学院动物科技学院

3、武警总医院检验科

摘要：Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络，在骨质代谢病和癌症研究等方面至关重要。目前为止，该信号通路中已发现19种Wnt信号配体，它们在调控骨代谢(破骨细胞的形成和骨吸收)、细胞增殖与分化、肿瘤形成中发挥作用。本文对Wnt配体的种类以及其在骨代谢方面中的作用进行阐述，为详细了解Wnt信号通路中Wnt信号配体在骨代谢病致病机制中的作用提供参考。

关键词：Wnt配体；Wnt信号通路；骨代谢；骨吸收；骨生成

Wnt基因由Nusse于1982年在研究小鼠乳腺癌时发现，当时命名为Int-1。进一步实验表明，该基因相当于胚胎发育过程中果蝇的无翅基因(Wingless)，且与无翅基因具有很高的同源性，故而合称为Wnt基因。Wnt基因调控的信号通路即Wnt信号通路，该信号通路具有高度保守性，不仅能调控细胞的形态与功能，还可调控生长、发育性疾病等过程。目前，Wnt信号通路已成为骨代谢相关疾病和肿瘤疾病的研究热点。Wnt配体作为该信号通路的关键组分，其种类和数量以及功能的正常行使将影响Wnt信号通路的正常功能运行。

Wnt信号配体概述

Wnt信号配体，亦称为Wnt蛋白。哺乳动物中现已发现19种以上Wnt蛋白，能通过自体分泌和旁分泌途径发挥作用。按结合方式将Wnt配体分为两类：(1)能结合卷曲蛋白受体(Frizzled，Fzd)和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(Lrp5/6)，进而激活经典Wnt/β-catenin的Wnt蛋白；(2)可结合Fzd蛋白激活cGMP蛋白，最终激活Wnt/Ca²⁺通路或者Wnt/PCP通路的Wnt蛋白。经典Wnt/β-catenin信号通路中，Wnt蛋白与Fzd卷曲蛋白受体和Lrp5/6结合，激活胞内散乱蛋白(Dishevelled，Dsh)，被激活的Dsh使由APC蛋白(adenomatous polyposis coli)、四合体骨架蛋白Axin、糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3-β)以及β-catenin组成的四聚体解体，进而使细胞内β-catenin含量增加，最终进入到细胞核内与转录因子集合，促使相关靶基因的表达。Wnt信号配体的数量、种类不同，所引起的结果也不同。因此，目前对Wnt信号配体功能的研究，可通过抑制或者促进某一类Wnt配体的数量，或用相同数量的特定Wnt配体来研究相应的功能。此外，也可通过基因敲除或操作Wnt信号配体的上游基因，观察敲除相应基因或改变上游基因后对其相应功能的影响。目前对19种Wnt配体中的18种配体(Wnt12功能未知)的相关功能进行了初步研究，本文围绕这18种配体的种类以及其在骨代谢中的作用进行综述(表 1)，为研究Wnt配体在骨代谢性疾病中的致病机制提供参考。

Wnt信号配体种类

参与调控骨代谢的Wnt配体

包含Wnt1、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt6、Wnt7b、Wnt10a、Wnt11和Wnt16。Wnt1可调控骨细胞的生成过程。Joeng等研究表明，在Wnt1条件性敲除小鼠模型(Wnt1fl/fl)中，Wnt1突变后能引起成骨不全和早发性骨质疏松症，是骨骼内稳态的关键Wnt配体。Wnt1在骨细胞中的缺失会导致骨量显著降低，而过表达Wnt1则会增加成骨细胞的数量以及增强其活性进而刺激骨的形成。Wnt3a可通过经典Wnt/β-catenin通路调控破骨细胞的功能。研究表明，Wnt3a不会直接影响白介素6(Interleukin-6，IL-6)的产生，但可抑制肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)刺激IL-6释放过程。IL-6的减少会降低破骨细胞的生成，进而使骨吸收减弱。Wnt4和Wnt16能抑制破骨细胞的形成和骨吸收。研究表明，在非经典Wnt信号通路中，Wnt4可通过转化生长因子β激酶1(transforming growth factor beta-activated kinase 1，Tak1)和成骨前体细胞抑制核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)的激活，从而减轻炎症反应和小鼠的骨流失，但其具体作用机制尚不清楚。由于NF-κB基因的缺失会阻扰破骨细胞的形成，NF-κB被激活可引起破骨细胞分化基因的表达，进而增加骨吸收。因此，推测Wnt4由于在非经典Wnt信号通路中抑制了NF-κB的激活而阻碍了破骨细胞的形成，降低了骨的吸收。Wnt16不仅可以直接作用于破骨祖细胞，也能间接增加成骨细胞中骨保护素的表达量，从而抑制破骨细胞的生成。同时，它也能抑制NF-κB的激活，最终降低骨吸收。Wnt5a可以引起成骨细胞分泌IL-6，促进破骨细胞的生成。Wnt11过表达后能协同转化生长因子β(Transforming growth factor β，TGF-β)使骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，其正常表达可抑制NF-κB的活性，阻碍破骨细胞的生成。因此，骨代谢相关的Wnt配体与各种骨关节病的发生密切相关，或许这些配体参与的功能路径可成为某些研发药物阻断的重要过程。

参与调控细胞增殖、分化、衰老、死亡等过程的Wnt配体

包含Wnt2、Wnt4、Wnt5a/5b、Wnt6、Wnt7a/7b、Wnt 8a/b和Wnt11等8种。例如，Wnt2能促进细胞增殖和迁移。研究表明，在胎盘发育过程中，敲除Wnt2基因可抑制滋养层细胞的增殖和转移。Wnt4信号通路的激活可以缓解地塞米松引起的小鼠胸腺上皮细胞(mouse thymus epithelial cell 1，MTEC1)的凋亡，促进MTEC1的增殖，表明Wnt4具有促进细胞增殖和参与调节细胞凋亡的作用。曹玉净等通过Transwell法检测细胞增殖，结果显示Wnt6敲除实验组相较于对照组，小鼠骨髓间充质干细胞的增殖较弱，表明Wnt6促进了细胞的增殖。Liu等使用MTT法检测骨髓间充质干细胞的增殖情况，过表达Wnt11会使细胞增殖变慢，且会使其处于G₀/G₁期，表明Wnt11可以调节细胞增殖。周长立等通过MTT法和Western blot对Wnt7a腺病毒感染的间充质干细胞进行研究，结果表明Wnt7a参与促进间充质干细胞的增殖和分化。综上所述，Wnt配体能参与细胞的生命活动，我们也能考虑通过外源性的增加或者抑制相关Wnt配体调控细胞的生命活动。

调节动物胚胎发育的Wnt配体

包含Wnt1、Wnt2、Wnt4、Wnt5a/5b、Wnt6、Wnt7、Wnt8、Wnt9b、Wnt11、Wnt14(Wnt9a)和Wnt16。例如，Wnt2不仅能在早期胚胎发育过程中调节脑的发育，还能调控胎盘的发育。在流产患者滋养层细胞中若Wnt2表达不足，可通过下调Wnt/β-catenin信号通路使滋养层细胞增殖和迁移。缺乏Wnt4抗体的卵母细胞易受精并分裂，而在培养卵母细胞时加入Wnt4抗体可明显抑制上述作用，表明Wnt4参与调控早期胚胎的形成和受精卵的分裂。高胜利等通过二甲基亚砜(DMOS)对小鼠胚胎心肌进行诱导分化，并在不同时间检测分化过程中Wnt8a的表达量，结果表明Wnt8a能在分化早期促进胚胎心肌的分化。虽然目前研究胚胎发育的Wnt配体并不多，但Wnt配体的确可以调控胚胎的发育，未来Wnt配体在胚胎发育过程中的研究是一个热点。

调控肿瘤、癌症发生的Wnt配体

包括Wnt1、Wnt2、Wnt5a/5b、Wnt6、Wnt7、Wnt9b、Wnt10a/10b、Wnt11、Wnt13(Wnt2b)、Wnt14(Wnt9a)和Wnt16。例如Wnt1作为microRNA-34抑制剂的靶蛋白，当microRNA-34a抑制剂表达量降低时可激活乳腺癌细胞MCF-7A中的Wnt/β-catenin信号通路，若用microRNA-34a抑制剂转染MCF-7A细胞，检测结果显示MCF-7A细胞的增殖力和侵袭力均减弱，表明Wnt1可增强癌细胞的迁移和增殖能力。Wnt5a过表达能促进胰腺癌细胞的迁移，并增强其侵袭力，而Wnt5a缺失则会抑制上述作用。此外，Wnt10a过表达会促进人乳腺癌细胞的增殖和迁移；Wnt10b的敲除会抑制体外胃癌细胞的增殖和迁移；Wnt11也会促进癌细胞的增殖、迁移，并增强其侵袭力。研究表明Wnt5a和Wnt11既能促进癌症的发生，又能抑制癌症的形成。Wnt5a和Wnt11在肝细胞癌中均表现出抑癌基因的作用，而在胃癌中表现出原癌基因的作用。由此可知，多数Wnt配体能促进癌细胞的增殖和迁移，同时也能增强其侵袭力。Wnt配体既然参与细胞的生命活动，肿瘤、癌症细胞的增殖、迁移等过程必然也受影响，因此，Wnt配体的含量可能成为治疗癌症的一个研究因素。

调节其他生理过程的Wnt配体

研究发现，Wnt信号配体对牙齿的发育具有重要作用，Wnt5a与牙周健康有关，而Wnt4和Wnt10a与牙齿的发育相关。在牙齿的发育过程中，Msxl和Pax9转录因子在牙芽期之外的其他阶段必不可少，而Wnt4能刺激Msxl的表达，表明Wnt4能调控牙齿的发育。此外，Wnt10a是牙齿发育最常见的突变基因，Wnt10a突变患者则会出现原发性牙齿缺陷和牙根缺陷等症状。Wnt14则参与调控视网膜的发育。Zhang等的研究表明，Wnt10b参与毛发生长。低水平激光照射小鼠可通过上调小鼠体内Wnt10b和β-catenin信号进而诱导处于生长期毛囊内毛发的生长。所以Wnt配体并不局限于影响某一过程，目前Wnt配体的研究并不深入，更值得进行一些研究找寻新的重要发现。

Wnt信号配体在骨代谢中的作用

骨重建是骨吸收和骨生成的动态平衡过程，可通过脊椎动物的活动使骨量维持在一定水平，从而实现骨中钙的稳态。若骨吸收和骨生成平衡被破坏，则会引起骨量减少或增多进而表现出病理性变化。因此，实现骨重建就是要确保骨吸收和骨生成维持平衡。

Wnt信号通路在骨生成中的作用

Wnt信号配体在骨生成的作用主要体现在促进成骨细胞的形成，增强骨的生成。骨细胞缺失Wnt1会引起骨量降低，而当其在骨细胞中过表达则能增加成骨细胞的数量和活性，促进骨的生成。Wnt3a可以通过与卷曲蛋白Fzd和LRP5/LRP6结合，激活经典Wnt信号通路，增加骨的生成。Chen等研究显示，Wnt7b能通过Mtorc1增加成骨细胞的数量和活性，促进骨的生成。在成骨前体细胞MC3T3E1中，Wnt11的过表达可以增加β-catenin含量，促进碱性磷酸酶的表达和骨的矿化。Wnt11也会引起Rspo2(一种能增强Wnt信号配体的因子)的表达，Rspo2过表达同样会引起骨的矿化，敲除Rspo2则能抑制这种作用，表明Wnt11对成骨细胞的分化有重要作用。Yu等构建一种转基因小鼠(OB-Wnt4)，该小鼠的Wnt4在成骨细胞分化时由小鼠Ⅰ型胶原启动子调控，使用RT-PCR检测OB-Wnt4转基因小鼠的Wnt4 mRNA在各组织的表达情况，最终证实Wnt4只在骨组织中表达；应用断层扫描技术分析股骨干骺端，显示OB-Wnt4转基因小鼠的骨密度明显高于野生型小鼠，且OB-Wnt4转基因小鼠骨体积与组织体积比值明显高于野生型小鼠；研究人员采用组织形态定量分析技术，发现3月龄的OB-Wnt4转基因小鼠骨生成率明显高于野生型小鼠，表明Wnt4在骨生成中发挥作用。

Lrp5/6在骨的生成中的作用主要涉及由SOST编码的骨硬化蛋白。骨硬化蛋白(硬骨素)作为Wnt信号通路的抑制剂，通过抑制Wnt信号配体与LRP5/6结合而阻断Wnt信号通路，它与硬化性骨化病和广泛性骨皮质增生综合征的致病机理有关，其典型特征表现为骨的增生。SOST基因缺失小鼠骨量增加，骨的生成增多，这与硬化性骨化病的特点相似。此外，甲状旁腺激素能减少SOST的表达。小鼠的骨细胞能表达由Pth1r基因编码的有活性的甲状旁腺激素受体，随着β-catenin信号的增加，骨量也会相应增多；相反，当骨细胞缺少Pth1r基因，SOST的表达会增加，则引起β-catenin信号减少和骨量降低。

Wnt信号通路在骨吸收中的作用

Wnt信号配体在骨吸收中的作用体现在促进破骨细胞的表达，加强骨吸收。Wnt4和Wnt16能通过增加成骨细胞中骨保护素(OPG)的表达抑制破骨细胞的生成和骨吸收，从而防止骨流失，相反，Wnt5a能抑制成骨前体细胞中骨保护素的表达，进而促使破骨细胞的生成，增强骨吸收。Cawthorn等研究显示，Wnt6和Wnt10a的稳定表达能促进破骨细胞的生成，而当敲除Wnt6和Wnt10a，破骨细胞的生成会受到抑制，表明Wnt6和Wnt10a能促进骨吸收，抑制骨生成。另一研究表明，Wnt3a和Wnt4在由野生型小鼠所制备的成骨细胞和骨髓细胞的混合培养液中可以抑制1 α, 25-二羟维生素D₃[1α, 25-(OH)₂D₃]而诱导破骨细胞生成，但在Opg-/-的小鼠所制备的混合培养液中却未出现相同结果，表明Wnt3a和Wnt4通过上调骨保护素的表达而抑制破骨细胞的生成。此外，成骨细胞分泌的Wnt4也能以旁分泌的方式抑制破骨细胞的形成，从而降低骨吸收。

成骨细胞中Wnt5a mRNA的表达量比Wnt16 mRNA高，经检测Wnt16在皮质骨的含量最高，但是Wnt5a和Wnt16在皮质骨中的表达并无明显差异，表明Wnt16与Wnt5a在破骨细胞的生成中可能起协同作用。进一步的研究表明，Wnt16并不能影响Wnt5a促进破骨前体细胞中Rank的表达。虽然Wnt16可以抑制破骨细胞的形成，但是Wnt5a能抵消Wnt16的抑制作用，因此，Wnt5a可以促进破骨细胞的形成，加强骨的吸收。

展望

Wnt信号配体具有多样性，成骨细胞、骨细胞、软骨细胞和骨髓细胞均可分泌Wnt配体。分泌的Wnt配体可通过Wnt信号通路发挥相应作用。目前，许多疾病的发生都涉及Wnt信号通路，如骨质疏松症和肿瘤等。本课题组目前正以犬肥大性骨营养不良为模型，研究肥大性骨营养不良与Wnt信号配体之间的关系，期望能揭示Wnt信号配体参与调控肥大性骨营养不良的作用机制。迄今为止，尽管对部分Wnt信号配体在骨代谢中有一定了解，但对Wnt12和Wnt15配体的功能无相关研究。将来对Wnt信号配体在骨代谢中的作用及调控机制的进一步深入研究，可能为骨代谢性疾病的诊断和治疗提供依据。