作者：聂义珍 闫朝岐 付红梅 赵兴鹃

单位：哈尔滨医科大学附属第二医院体检中心

摘要：目的 分析冷刺激对于骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)成骨分化的影响，为研究环境温度对于骨质疏松症的影响提供可信的依据。方法 选取C57BL/6小鼠，随机分为常温对照组和冷刺激组。实验结束后取双侧股骨、胫骨，全骨髓贴壁法分离BMMSCs并向成骨细胞定向诱导分化。取C57BL/6小鼠的正常BMMSCs体外进行冷刺激，细胞分成37 ℃组、37 ℃+抑制剂组[p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)抑制剂SB203580]、18 ℃组、18 ℃+抑制剂组。结果 冷刺激使BMMSCs呈纺锤状和成纤维细胞样改变和细胞增殖水平下降(P＜0.01)。茜素红染色发现，冷刺激7 d后细胞有聚集趋势；体外实验也观察到冷刺激使细胞聚集且染色加深，加入SB203580后，成骨分化减弱。冷刺激提高了成骨分化标志物Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor2，Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)和胶原蛋白-1(collagen-Ⅰ)mRNA表达(P＜0.01)，SB203580抑制了这些标志物的表达。冷刺激显著诱导了p38 MAPK的磷酸化(P＜0.01)，SB203580可下调冷刺激引起的p-p38 MAPK水平的提高(P＜0.01)。结论 冷刺激使BMMSCs增殖能力下降，同时活化p38 MAPK通路促进BMMSCs向成骨细胞转化。

关键词：冷刺激；骨髓间充质干细胞；成骨分化

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)属于低分化、具有多种分化能力并且是以增殖状态为主的干细胞。BMMSCs受不同条件的影响可以转化成不同的细胞，如成骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、软骨细胞等。成骨细胞是骨形成及人体骨组织重建的决定性因素，同时它也是机体维持骨量及促进骨骼生长发育的重要因素。其来源于BMMSCs，要经过BMMSCs增殖、细胞外基质合成、细胞成熟和矿化等连续过程。Zhou等实验发现p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号系统可以正向调控小鼠BMMSCs分化为成骨细胞。Fujiwara等实验显示在果蝇体内急性冷刺激可以使p38 MAPK信号通路被活化，提升了p38 MAPK的磷酸化程度。但是，冷刺激是否可以通过p38 MAPK通路影响小鼠BMMSCs的成骨分化尚不清楚。

材料与方法

动物及分组

选取36只健康6~8周龄雄性C57BL/6小鼠，随机分成2组：常温对照组和冷刺激组。对照组在室温20 ℃左右饲养，冷刺激组在4 ℃左右饲养，每组再根据饲养时间7、14、21 d分为3组，共6组。顺应条件变化先饲养7 d，各组小鼠均为标准饮食。分离双侧股骨、胫骨，小心分离股骨、胫骨旁边连着的肌肉等软组织，使用全骨髓贴壁法分离培养BMMSCs。

BMMSCs的分离、培养

取8周龄寒冷刺激与正常小鼠，颈椎脱臼处死。剪断胫骨骨干两端，显露出骨髓腔，用2 mL注射器吸取DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，吹打制成均匀的细胞悬液。将分离后的细胞悬液1 500 r/min离心10 min，弃上清，加入3 ml红细胞裂解液吹悬细胞，室温静置3 min到达时间后将细胞悬液1 500 r/min离心5min；弃上清，加入5 mL PBS吹悬细胞，清洗细胞2次；加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养。P3代细胞开始，细胞形态较均一，生长速度较快，一般4 d就可传代一次，可用于后续实验。

BMMSCs的鉴定

取P3代BMMSCs弃去原有培养基，用PBS漂洗3次，加入1 mL 0.25%胰酶，镜下观察细胞形态，当细胞稍微变圆时，加入含血清培养基终止反应，离心收集细胞，PBS清洗细胞1次后，加入100 μL的PBS重悬细胞，调整密度为1×10⁶/mL。流式管中加入带有标记的CD44和干细胞抗原-1(Sca-1)抗体(其中包括对照管)，37 ℃孵育30 min，离心收集细胞，小心吸尽上清，PBS漂洗3次。500 μL PBS重悬细胞，进行流式检测。

细胞加药染色

细胞传代3次后，将细胞分为4组，使用Cyagen MUBMX-90021小鼠BMMSCs成骨诱导分化培养基。每隔3 d换用新鲜的诱导分化完全培养基(使用前需预热至37 ℃)，诱导10 d左右，视细胞的形态变化及生长情况后进行实验。37 ℃组：细胞于37 ℃培养；37 ℃+抑制剂组：细胞于37 ℃培养，10 μmol/L p38 MAPK抑制剂SB203580预先处理细胞1 h；18 ℃组：细胞于18 ℃培养细胞；18 ℃+抑制剂组：细胞于18 ℃培养，10 μmol/L p38 MAPK抑制剂SB203580预先处理细胞1 h；到达指定时间点后PBS洗3次，加入4%多聚甲醛室温固定细胞30 min，加入5%茜素红染色过夜，次日拍照。

Western blot检测

由各组细胞中抽提出总蛋白，通过BCA反应进行蛋白质定量。将蛋白进行SDS-PAGE电泳和转印，转印结束后取出PVDF膜，浸入TTBS中，摇床摇动5 min。倒掉TTBS，将PVDF膜浸入脱脂奶粉溶液中。用5%(M/V)脱脂奶粉稀释抗体，制成抗体工作液。将抗体工作液倒入杂交袋中，放入封闭好的PVDF膜，用压膜机封口，进行抗体孵育。加入Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor2, Runx2)抗体(1:500)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)抗体(1:500)、骨桥蛋白(osteopontin, OPN)抗体(1:1 000)、胶原蛋白-1(collagen-Ⅰ)抗体(1:400)、P38抗体(1:500)、p-P38抗体(1:500)，4 ℃过夜孵育。孵育抗体后的PVDF膜从杂交袋中取出，浸入TTBS中，将PVDF背面的水分用滤纸吸干，然后平铺到保鲜膜上，均匀的洒上ECL发光液，用另一张保鲜膜覆盖其上，用玻璃棒赶出多余的液体，然后转入暗盒中，在暗室进行曝光。将胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带的光密度值。

荧光定量

利用总RNA提取试剂盒(天根)提取样本总RNA，将得到的RNA样本进行反转录，对上步实验所得的RNA样本进行反转录以得到对应的cDNA。进行实时荧光定量分析，反应条件为95 ℃，反应10 min。进行40个循环，95 ℃，10 s，60 ℃，20 s 72 ℃，30 s，冷却到4 ℃，5 min，相关基因表达的水平利用韩国BIONEER公司生产的ExicyclerTM 96荧光定量仪进行荧光定量分析。引物序列如下：ColⅠ-F AAAGACGGGA GGGCGAGTG；ColⅠ-R CCATAGGACATCTGGG-AAGCAA；Runx2-F GGAGCGGACGAGGCAAGAG-T；Runx2-R AGGAATGCGCCCTAAATCAC；BSP-F GAACAAACAGGCAACGAATA；BSP-R GGTAGCC-AGATGATAAGACAGA；OPN-F TTCACTCCAATC-GTCCCTAC；OPN-R TTAGACTCACCGCTCTTCAT；β-actin-F CTGTGCCCATCTACGAGGGCTAT；β-actin-R TTTGATGTCACGCACGATTTCC。

统计学方法

用SPSS17.0统计学软件分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，运用多因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

流式细胞术检测BMMSCs表面抗原CD44、Sca-1的表达

BMMSCs呈现纺锤状和类似成纤维细胞形状改变(图 1A)。进一步检验BMMSCs表面标志物，结果显示BMMSCs阳性表达CD44和Sca-1(图 1B)

MTT法检测BMMSCs的增殖能力

MTT结果显示，细胞培养12及24 h，冷刺激处理对BMMSCs细胞增殖水平并无显著影响；但处理48 h，冷刺激21 d的BMMSCs细胞增殖能力较对照组明显下降(P＜0.01)(图 2)。

茜素红染色观察冷刺激后BMMSCs细胞的成骨分化情况

冷刺激后BMMSCs茜素红染色发现，冷刺激7 d后细胞有聚集趋势，染色加深；冷刺激14和21 d变化不明显(图 3)。

体外观察BMMSCs细胞茜素红染色情况

18 ℃组细胞与37 ℃标准组(未加抑制剂组)相比，细胞聚集且染色加深，加入抑制剂后，成骨分化减弱，细胞分散，颜色降低。37 ℃与37 ℃+抑制剂组差异不显著(图 4)。

冷刺激对成骨分化标志物表达的影响

冷刺激显著提高了Runx-2水平(P＜0.01)。Western blot结果显示，冷刺激组磷酸化的p38 MAPK(p-p38 MAPK)水平显著提高(P＜0.01)；冷刺激对于p38 MAPK的水平变化不明显(图 5)。

体外冷刺激对成骨分化标志物表达的影响

与37 ℃组相比，p38 MAPK抑制剂SB203580对细胞中成骨分化标志物(Runx-2、OPN、BSP、collagen-Ⅰ)mRNA表达水平没有任何影响。冷刺激显著提高了Runx-2、OPN、BSP和collagen-Ⅰ的mRNA水平(P＜0.01)，然而SB203580显著降低了这些标志物的表达水平(图 6A)。Western blot结果与real-time PCR结果相一致(P＜0.01)(图 6B)。37 ℃+ SB203580组中磷酸化的p38 MAPK(p-p38 MAPK)水平显著下调(P＜0.05)。并且，冷刺激显著诱导了p38 MAPK的磷酸化(P＜0.01)，SB203580显著下调了冷刺激引起的p-p38 MAPK水平的提高(P＜0.01)。

讨论

罗依等研究证明冷冻BMMSCs，在温度下降的过程中，容易引起“溶质损伤”或“胞内冰损伤”。本实验MTT结果显示，细胞处理48 h时，冷刺激21 d的BMMSCs细胞增殖能力较对照组下降明显(P＜0.01)。BMMSCs呈现纺锤状和成纤维细胞样改变。分析冷刺激使BMMSCs增殖能力降低原因可能是低温破坏了骨髓微循环，使微血管的内皮细胞受到损伤，前列环素(prostaglandin Ⅰ2，PGⅠ2)合成减少，血管活性物质生成增多，导致了血小板的黏附和会聚，最终导致骨髓微循环障碍和BMMSCs增殖能力的降低。另一种原因可能为冷刺激直接损伤BMMSCs，有研究证实温度可以诱导蛋白的变化和破坏细胞膜，减弱细胞膜的类脂质功能。但是这种细胞的损伤与温度降低的程度及温度下降的作用时间两方面关联明显。

体内实验中茜素红染色显示冷刺激7 d后细胞有聚集趋势，但14、21 d均不明显。这种改变是否与体内实验时，机体的冷适应有关，使实验中并没有显示出细胞的成骨分化随刺激时间增加而增强的趋势。体外分离培养BMMSCs并冷刺激处理后茜素红染色显示，18 ℃组细胞与37 ℃标准组(未加抑制剂组)相比，细胞聚集且染色加深，表明冷刺激促进了细胞的成骨分化，而且加入p38 MAPK抑制剂后，成骨分化减弱，细胞分散，颜色降低。说明冷刺激有可能通过p38 MAPK通路影响BMMSCs成骨分化。

Runx2是调控成骨细胞分化的重要因子，在骨的形成中起着关键的角色。现在的研究用Runx2衡量骨髓间充质细胞的成骨能力。Runx2在成骨分化的信号途径中被认为具有核心作用，能够诱导BMMSCs向成骨细胞定向分化，参与成骨形成的早期阶段并促成骨细胞的成熟。

胶原蛋白Ⅰ是由成骨细胞分泌，它明显促进成骨细胞的生成和矿化，是成骨细胞形成早期的标志性蛋白。OPN是一种带负电的非胶原性骨基质糖蛋白，骨细胞、破骨细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、多种肿瘤细胞及不同成熟阶段的成骨细胞均能合成和分泌OPN分子。在分化早期，前成骨细胞合成OPN是一个相对分子质量55 000道尔顿的低磷酸化蛋白，此时的OPN与骨基质的形成有关。

而成骨细胞合成相对分子质量44 000道尔顿的高磷酸化蛋白，能调节羟基磷灰石晶体生长，因此，OPN被认为是成骨细胞分化成熟的标志。BSP是存在于矿化结缔组织内高度硫基化和磷酸化的糖蛋白，富含唾液酸，对调节骨组织的功能发挥一定作用，可特异表达在生理或病理性矿化组织中，在分化的成骨细胞中特异表达。BSP在未成熟成骨细胞的前体细胞中不表达，分化早期短暂表达，后在分化成熟的成骨细胞中表达量明显增加。

MAPKs是细胞内重要的信号传递者，参与多种生理过程的调节。p38信号途径是MAPK家族中的重要组成部分，p38 MAPK可以由细胞外的多种应激包括紫外线、放射线、热休克、促炎因子、特定抗原及其他应激反应活化。有研究结果表明，BMP通过激活p38 MAPK-Smad信号通路增强C2C12细胞成骨分化和矿化，通过增加成骨细胞生成和减少破骨细胞(osteoclast，OC)分化改善骨质疏松。Choi等研究发现p38通路增强骨代谢，主要通过促进成骨分化和抑制破骨细胞形成。Kim等研究发现BMP启动p38MAPK-Smad信号传导系统，增加了成骨细胞的生成。

本研究结果显示冷刺激显著提高了Runx-2水平(P＜0.01)。冷刺激组磷酸化的p38 MAPK(p-p38 MAPK)水平显著提高(P＜0.01)。但冷刺激对于p38 MAPK的水平变化不明显，说明冷刺激可能因为激活p38 MAPK通路而引起BMMSCs向成骨细胞转化。

为了检验上述研究结论，本实验检测细胞在体外冷刺激后其Runx-2、OPN、BSP和胶原-Ⅰ的mRNA水平显著提高(P＜0.01)，而SB203580显著降低了这些标志物的表达水平。Western blot结果也与real-time PCR结果相一致(P＜0.01)。37 ℃+SB203580组磷酸化的p38 MAPK(p-p38 MAPK)水平显著下调(P＜0.05)。并且，冷刺激显著诱导了p38 MAPK的磷酸化(P＜0.01)，SB203580显著下调了冷刺激引起的p-p38 MAPK水平的提高(P＜0.01)。说明冷刺激能够激活p38 MAPK通路进而促进BMMSCs转化为成骨细胞。越来越多的研究表明p38 MAPK通路在调控BMMSCs转化为成骨细胞的过程中具有重要的影响力。然而冷刺激对成骨细胞基因表达的影响和引起这种变化可能的机制需要进一步的探讨。