作者：柴利杰¹ 辛莹² 李静怡³ 王亭亭² 李珊² 郑丽丽²

单位：

1、阜外华中心血管病医院内分泌科

2、郑州大学第一附属医院内分泌科

3、郑州大学第一附属医院整形外科

摘要：目的 为探讨胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)受体激动剂对骨保护作用的机制，应用GLP-1受体激动剂(艾塞那肽)干预高脂导致的小鼠成骨细胞凋亡实验，观察艾塞那肽在成骨细胞凋亡过程中的保护作用。方法 体外应用含500 μmol/L棕榈酸(palmitic acid，PA)完全培养基处理小鼠成骨细胞MC3T3-E1 14模拟体内高脂环境，分组如下：正常对照组(0 μmol/L PA)、高脂组(500 μmol/L PA)、高脂+艾塞那肽(1、10、100、1 000 nmol/L)浓度梯度组分别孵育成骨细胞24 h。根据实验结果选择艾塞那肽最佳浓度100 nmol/L进行后续实验，分正常对照组、艾塞那肽组、高脂+艾塞那肽组、高脂组，观察艾塞那肽对成骨细胞增殖和凋亡的影响。Cell Counting Kit-8试剂盒检测细胞增殖活性；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率；RT-qPCR技术检测各组细胞内质网应激相关基因GRP78、CHOP、Caspase-12 mRNA的表达。结果 与正常对照组相比，高脂组细胞活性明显下降(OD值：2.612±0.106 vs.2.394±0.088，P＜0.01)；与高脂组相比，高脂+艾塞那肽1 000 nmol/L组、高脂+艾塞那肽100 nmol/L组、高脂+艾塞那肽10 nmol/L组细胞增殖活性明显升高(OD值：2.394±0.088、2.547±0.068、2.579±0.060、2.496±0.114，P＜0.05)，高脂+艾塞那肽1 nmol/L组对细胞的增殖活力无明显影响(P＞0.05)。选择艾塞那肽100 nmol/L为最佳浓度重复干预后发现，与高脂组相比，高脂+艾塞那肽100 nmol/L组的细胞增殖活力明显升高(OD值：2.161±0.203，2.399±0.193，P＜0.01)；细胞凋亡率明显下降(19.633%±3.169%，5.400%±2.304%，P＜0.01)；GRP78、CHOP mRNA的表达量明显下降(P＜0.01)，Caspase-12 mRNA的表达量回升(P＜0.05)。结论 GLP-1受体激动剂艾塞那肽可能通过内质网应激途径，改善PA造成的小鼠成骨细胞增殖活性减低以及凋亡的发生。

关键词：成骨细胞；凋亡；艾塞那肽；内质网应激

随着人口老龄化，骨质疏松症日益成为全球性流行病，目前估计有2亿多人患有骨质疏松症，根据国际骨质疏松症基金会最新的统计资料，全球人群中，1/3的绝经女性和1/5的男性患有骨质疏松症。骨质疏松症是以低骨量，骨组织退化和骨微结构破坏为特征的一种疾病，骨吸收量＞骨形成量，导致骨强度受损和骨折风险增加。目前临床上作用于破骨细胞的药物主要是通过抑制破骨细胞成熟、增殖、活性从而抑制骨吸收，而作用于成骨细胞的药物较少。探索和开发作用于成骨细胞、促进骨形成的新药物，是当前预防和治疗骨质疏松症药物研发领域的热点。

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)，是一种由空肠和回肠细胞分泌的肠道激素，其受体除了在胰岛β细胞有表达外，还普遍存在于其他多种组织器官中。艾塞那肽是GLP-1受体激动剂的一种，可以通过与各组织器官的GLP-1受体相结合，发挥类似GLP-1的生理作用。近年来越来越多的研究发现，GLP-1及其受体激动剂除具有控制血糖以外，还具有包括骨骼在内的许多胰腺外的益处。笔者前期研究证实，棕榈酸(palmitic acid，PA)是通过内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)诱导成骨细胞凋亡的，也提示抑制内质网应激可以改善高脂导致的成骨细胞凋亡，并且其他多项研究支持内质网应激促进成骨细胞的凋亡，在骨质疏松的发病机制中发挥重要的作用。GLP-1可通过抑制内质网应激从而改善血管内皮细胞、心肌细胞、肝细胞等多种细胞凋亡。

本研究体外应用PA处理成骨细胞模拟体内高脂环境，给予GLP-1受体激动剂(艾塞那肽)干预高脂导致的成骨细胞凋亡，观察艾塞那肽对成骨细胞凋亡的保护作用。

材料与方法

材料

小鼠成骨细胞MC3T3-E1 14购自中国科学院上海细胞研究所细胞库；艾塞那肽注射液购自礼来公司，α-MEM培养基购自郑州索莱宝公司，CCK-8检测试剂盒购自日本Dojindo公司，胎牛血清、棕榈酸钠购自美国Sigma公司，反转录试剂盒、细胞裂解液(Trizol)购自中国TAKARA公司，SYBR Mix购自德国罗氏公司，二甲基亚砜(DMSO)购自北京鼎国公司，细胞凋亡检测试剂盒购自中国Beyotime公司。

方法

细胞增殖活性检测：按照CCK-8试剂盒说明书进行操作。在96孔板中接种细胞悬液，100 μL/每孔，密度为5×104/mL，置于37 ℃，5% CO2的恒温培养箱中预孵育24 h；结合前期实验，选择500 μmol/L的PA干预24 h诱导成骨细胞凋亡。实验分组：(1)正常对照组；(2)高脂+艾塞那肽1 000 nmol/L组：500 μmol/L的PA和1 000 nmol/L的艾塞那肽；(3)高脂+艾塞那肽100 nmol/L组：500 μmol/L的PA和100 nmol/L的艾塞那肽；(4)高脂+艾塞那肽10 nmol/L组：500 μmol/L的PA和10 nmol/L的艾塞那肽；(5)高脂+艾塞那肽1 nmol/L组：500 μmol/L的PA和1 nmol/L的艾塞那肽；(6)高脂组：500 μmol/L的PA。每组设置3个复孔，分别孵育成骨细胞24 h。选出艾塞那肽最佳浓度为100 nmol/L干预成骨细胞24 h，重新分组并进一步干预：(1)正常对照组；(2)艾塞那肽100 nmol/L组；(3)高脂+艾塞那肽100 nmol/L组；(4)高脂组。每组设置3个复孔；向每孔中加入10 μl的CCK-8试剂，37 ℃，5% CO2的恒温培养箱孵育2 h；酶标仪测定各孔在450 nm处的OD值，重复3次。

细胞凋亡率检测：采用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测，正常对照组、艾塞那肽100 nmol/L组、高脂+艾塞那肽100 nmol/L组和高脂组，每组设3个复孔。培养结束后，用胰蛋白酶消化收集各组细胞后，依照试剂盒说明书进行，向细胞悬液中加入Annexin V-FITC和PI各5 μL后混合均匀，室温孵育15 min；在1h内完成流式细胞仪对细胞凋亡率的检测，重复3次。

RT-qPCR检测GRP78、CHOP和Caspase-12 mRNA的表达量：正常对照组、艾塞那肽100 nmol/L组、高脂+艾塞那肽100 nmol/L组和高脂组，按照Trizol法提取RNA说明书指示进行操作；并对RNA进行浓度测定；反转录为cDNA；所有引物均由上海生工生物工程有限公司设计合成，GAPDH作为内参，所用引物名称、序列见表 1。反应体系配置：cDNA(反转录后稀释10倍)2 μL，Forward Primer(1 μmol/L)4 μL，Reverse Primer(1 μmol/L)4 μL，SYBR Mix 10 μL。按以下反应要求设置条件：95 ℃ 10 min(预变性)；40个循环：95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s；72 ℃ 10 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s，4 ℃保持。结果采用2－ΔΔCt法计算基因的相对表达水平。

统计学方法

采用SPSS21.0统计软件对实验结果进行统计学分析，数据以均数±标准差(x±s)表示。实验数据均进行正态分布检验及方差齐性检验，两组间比较采用独立样本检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

结果

不同干预因素对成骨细胞增殖活性的影响

采用CCK-8法测定成骨细胞在450 nm波长处OD值，间接反应成骨细胞增殖活性。与正常对照组相比，高脂组OD值下降了0.218(P＜0.01)；与高脂组相比，高脂+艾塞那肽1 000 nmol/L、高脂+艾塞那肽100 nmol/L、高脂+艾塞那肽10 nmol/L组的OD分别升高了0.153(P＜0.01)、0.185(P＜0.01)、0.102(P＜0.05)，高脂+艾塞那肽1 nmol/L组的OD值升高了0.082(P＞0.05)(表 2)。因高脂+艾塞那肽100 nmol/L组OD值升高最明显，故选取艾塞那肽100 nmol/L作为最佳浓度，进一步重复干预发现，高脂+艾塞那肽100 nmol/L组的OD值为2.399±0.193，较高脂组明显升高了0.238(P＜0.01)(表 3)。

不同干预因素对成骨细胞凋亡率的影响

与正常对照组相比，高脂组成骨细胞凋亡率明显升高了18.122%(P＜0.01)；与高脂组相比，PA+艾塞那肽100 nmol/L组成骨细胞凋亡率下降了14.233%(P＜0.01)(表 3)。

不同干预因素对成骨细胞内质网应激相关基因表达的影响

与正常对照组相比，高脂组GRP78、CHOP mRNA表达量均明显升高，分别升高了0.571(P＜0.01)、0.213(P＜0.01)，而Caspase-12 mRNA表达量下降了0.541(P＜0.01)；100 nmol/L艾塞那肽处理后，与单纯高脂组相比，其GRP78、CHOP mRNA表达量分别下降了0.336(P＜0.01)、0.178(P＜0.01)；Caspase-12 mRNA表达量升高了0.239(P＜0.05)(表 4)。

讨论

骨质疏松症是人类最常见的骨骼疾病，无关性别和种族，其发病率随着人口老龄化而增加。骨质疏松症的特征主要是骨量减少和骨微结构破坏，致使骨脆性增加，从而易发生骨折的全身性骨骼系统疾病。在骨折发生之前，这是一种沉默的疾病，会导致严重的继发性健康问题甚至死亡。生理情况下，骨骼的完整性由不断重复、时空耦联的破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成过程动态平衡维持，病理情况下，其平衡被打破，将导致骨质量和(或)数量的病理改变，这是骨质疏松症的主要发病机制。

近年研究发现，肥胖症与骨质疏松症的关系密切，研究显示肥胖主要通过调节骨骼系统(特别是成骨细胞、骨细胞、破骨细胞和骨微循环)和肌肉系统(主要是肌细胞)导致骨质疏松症。肥胖者往往伴随高脂血症，高脂血症引起的炎症反应、氧化应激、脂质异常聚集及氧化脂质等导致骨代谢紊乱，加速了骨质疏松的疾病进程。Halade等对高脂血症性骨质疏松动物模型研究也证实了肥胖对骨骼的负面影响，即随着骨髓质中脂肪含量的增加骨密度降低，过氧化物酶体增殖物激活受体γ、组织蛋白酶κ上调和骨髓中促炎因子(白介素6及肿瘤坏死因子α)增加。Sarkis等关于21 500例人群研究结果显示，较低的脂肪摄入量和良好的脂质分布以及更好的LDL-C水平有利于保护骨密度和骨代谢。目前，肥胖导致骨质疏松的具体机制尚不明确。众多研究数据显示，在肥胖小鼠或肥胖患者体中，炎症反应和氧化应激参与的ERS广泛存在。ERS导致细胞凋亡在骨质疏松症发病中发挥重要作用，在小鼠模型中，ERS减少了小梁骨面积/总面积以及成骨细胞的数量。而ERS诱导细胞凋亡的机制可能为：发生ERS时，存在于内质网上的葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)大量表达，为了对蛋白质进行重新折叠，GRP78与激活作用转录因子(activating transcription factor 6，ATF6)、跨膜蛋白激酶1(inositol requiring kinase1，IREl)、双链RNA依赖的蛋白激酶样ER激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)解离，导致ATF6、IREl和PERK分别激活，并激活3条凋亡通路，CHOP转录激活、JNK信号途径活化、Caspase-12的活化等，从而导致细胞凋亡。笔者前期研究显示：高脂环境下，成骨细胞增殖活性明显下降，凋亡率增加，ERS相关基因的表达量增加，该研究结果与前期研究结果以及相关文献报道一致。因此，抑制ERS、促进成骨细胞增殖，可能成为预防高脂性骨质疏松症发生发展的一个新的靶点。

GLP-1是由空肠和回肠细胞分泌的肠道激素，其受体在体内广泛存在。但GLP-1在体内半衰期只有1~2 min，很快就被体内二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase 4，DPP-Ⅳ)降解。艾塞那肽是GLP-1受体激动剂，与天然GLP-1相比具有大约53%的序列同源性，并且是二肽基肽酶-Ⅳ酶的较差底物，具有相对较长的半衰期(2.4 h)，艾塞那肽通过激活各组织器官的GLP-1受体，发挥类似GLP-1的生理功能。Schisano等通过将人内皮细胞暴露于高糖环境下诱发ERS，并应用利拉鲁肽干预，可阻止ERS的发生，从而阻止高糖诱导的人内皮细胞中的线粒体碎裂和细胞凋亡。其他研究显示脂毒性条件下CHOP、Caspase-12和JNK通过增强它们的活性在非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)模型中参与了ERS，这些活化的蛋白质可以被GLP-1明显抑制，并且GLP-1以剂量依赖性方式促进HepG2细胞存活并减弱细胞凋亡。在高糖高脂模型大鼠中发现，应用利拉鲁肽可以抑制ERS，降低GRP78、CHOP、Caspase-12的表达，降低血糖、血脂，从而起到保护心脏的作用。GLP-1受体分布广泛，长骨来源的成骨细胞中也有分布，应用GLP-1受体激动剂100 nmol/L时可以明显促进成骨细胞增殖与成骨标志物的表达，在一定程度上改善氧化应激诱导的成骨细胞损伤。Lee等应用两种不同剂量(10、100 nmol/L)的GLP-1作用于脂肪源性干细胞，可以增加碱性磷酸酶的活性和上调碱性磷酸酶mRNA的表达，并促进钙矿化；同时，GLP-1明显抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ、脂蛋白脂肪酶和脂肪细胞蛋白2的表达，这种促进成骨分化，抑制成脂分化的作用在100 nmol/L时达到最大显著效应。另一项研究对卵巢切除的Wistar雌鼠使用exendin-4，能够改善大鼠的腰椎和股骨的骨小梁厚度、体积和数量，增加骨密度，并减少小梁间距，当用exendin-4处理大鼠骨髓基质细胞时，成骨细胞特异转录因子、碱性磷酸酶和胶原α1 mRNA表达水平升高，过氧化物酶体增殖物激活受体γ下降。基于GLP-1可以明显抑制其他多种细胞发生ERS以及对成骨细胞增殖的促进作用，GLP-1受体激动剂及DPP-4抑制剂有望成为治疗高脂性骨质疏松症的新药。

在本实验中，与正常对照组相比，高脂组成骨细胞活性下降，凋亡率增加，内质网应激相关基因GRP78、CHOP mRNA表达量明显上升，Caspase-12 mRNA表达量下降。与高脂组相比，高脂组+艾塞那肽100 nmol/L组成骨细胞增殖活性明显增加，细胞凋亡率明显下降，ERS相关基因GRP78、CHOP mRNA表达量均降低，Caspase-12 mRNA表达量回升。提示GLP-1受体激动剂艾塞那肽可能通过内质网应激途径，改善棕榈酸造成的小鼠成骨细胞增殖活性减低以及凋亡的发生。

综上，GLP-1受体激动剂艾塞那肽可能通过抑制内质网应激，在某种程度上改善高脂诱导的小鼠成骨细胞凋亡，该研究为高脂性骨质疏松症的治疗提供了新的思路和依据。