作者：吴建成 孙杰 郭志锐 秦岭 刘璠 张亚峰

单位：

1、华北理工大学附属医院血液内科

2、同济大学附属杨浦医院骨科

摘要：目的  探讨血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)I/D基因多态性以及血清ACE活性与中国老年人骨丢失的关系。方法  采用问卷调查方式采集研究对象的人体测量学数据、生活方式、个人既往病史及用药史；利用双能X线骨密度仪测量骨密度；采集清晨空腹血分离血清及提取DNA，采用PCR分析ACE I/D基因多态性；血清ACE活性采用动力学试剂盒测定。利用4年随访时的骨密度和基线骨密度计算骨密度改变情况。采用多元线性回归分析方法分析ACE I/D基因多态性、血清ACE活性与骨丢失的关系。结果  多元线性回归分析结果显示，男性(n=1 582)和女性(n=1 730)受访者ACE I/D基因多态性与骨丢失无关(男性脊柱、髋部、股骨颈的P值分别为0.914，0.345和0.536，女性脊柱、髋部、股骨颈的P值分别为0.711，0.536和0.650)。男性(n=1 119)和女性(n=1 067)受访者，血清血管紧张素转化酶活性与中国老年人的骨丢失无相关性(男性脊柱、髋部、股骨颈的P值分别为0.698、0.311和0.548，女性脊柱、髋部、股骨颈的P值分别为0.705，0.915和0.249)。结论  ACE I/D基因多态性及血清ACE活性与中国老年人的骨丢失没有相关性。

关键词：血管紧张素转化酶；I/D基因多态性；血清血管紧张素转化酶活性；骨密度

血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)是一种经膜锌脂金属蛋白酶，它在血管活性肽的代谢中起重要作用，它能够将十肽血管紧张素Ⅰ转化为具有血管收缩生物学活性的八肽血管紧张素Ⅱ，此外，ACE还能够降解缓激肽。ACE依靠锚合肽粘附于血管内膜表面，能够被ACE分泌酶清除，形成可溶性酶，称为血清ACE。

1990年，Rigat等发现ACE基因第16内含子有一段287个碱基对的插入(insertion, I)和缺失(deletion, D)多态性。该基因多态性与白种人约50%的血清血管紧张素活性变异相关，DD基因型血清ACE活性最高，II基因型血清ACE活性最低。亚洲人的ACE I/D基因多态性同样与血清ACE活性相关，其趋势与白种人相同。ACE基因多态性与多种疾病相关，如动脉粥样硬化、冠心病、卒中、糖尿病肾病、阿尔茨海默氏病等。既往有研究报道，ACE抑制剂治疗能够增加女性DD基因型携带者的骨密度，提示ACE I/D多态性可能与骨代谢相关。

有报道指出，血清ACE活性相对于ACE I/D基因多态性更能预测冠脉支架置入后再狭窄的风险，这可能是因为同样基因型携带者，血清ACE活性变异较大。尽管ACE I/D基因多态性显著影响血清ACE活性，DD基因型携带者的血清ACE活性几乎是II基因型携带者的2倍，DD基因型携带者的血清ACE活性仍然变异较大。作为分类变量，ACE I/D基因多态性不如作为连续变量的血清ACE活性精确。血清ACE活性的生理和病理生理作用仍不十分明确。有报道称在ACE DD基因型的患者，使用ACE抑制剂能够增加骨密度。

笔者既往的研究结果显示ACE I/D基因多态性、血清ACE活性与中国老年人的骨密度没有相关性，本研究利用相同队列研究的纵向资料，分析ACE I/D基因多态性、血清ACE活性和中国老年人骨丢失的关系。

对象与方法

对象

本研究对象来源于两项队列研究Mr.OS和Ms.OS，该两项队列研究设立的目的是研究在香港居住的老年人骨质疏松性骨折的危险因素，其中Mr.OS是国际多中心研究，除香港之外还有美国和瑞典中心。通过社区招募的方式，采用分层采样方法，以形成代表香港老年人口特征的队列。排除标准：不能提供知情同意书，不能提供个人病史资料，不能行走，进行过髋关节置换术，或者存在基础疾病，经研究者判断不能顺利完成随访计划。两项队列研究各招募了2 000名65岁及以上受访者，通过分层采样的方式，65~69、70~74及75岁以上者各占三分之一。受访者采集一次基础数据，每2年随访一次，共随访2次。只有完成2次随访的受访者被纳入本研究。在基础调查以及2次随访的任何一点报道吸烟和使用抗骨质疏松药物的受访者被排除在分析ACE I/D基因多态性和骨丢失的研究之外。在分析血清ACE活性与骨丢失的相关性时，ACE抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂使用者也被剔除。药物使用时间根据受访者汇报的药物使用次数估算。汇报2次及以上药物使用被认为是使用者。Mr.OS和Ms.OS研究计划得到了香港中文大学临床研究伦理委员会的批准。

调查方法

通过面对面问卷调查的方式采集受访者的人体测量学数据、生活习惯、个人既往病史及用药情况。

骨密度测量

利用双能X线骨密度仪(dual-energy X-ray absorptiometry，DXA)测量股骨近端及腰椎骨密度。利用腰椎标准件每日进行DXA校正，测量的变异系数为0.7%。利用4年随访时的骨密度减去基线骨密度再除以基线骨密度，并采用百分比的形式表示年化骨密度的改变。

ACE I/D基因型分析

采集清晨空腹外周静脉血，分离血清和提取DNA。利用PCR鉴别ACE I/D基因型。PCR的5′端引物序列为5′-AGAGAGACTCAAGCACGCCC-3′，3′端引物序列为5′-ACCCAAGTGCCAGTGATGTT-3′。

ACE活性测定

血清ACE活性利用Bühlmann Laboratories AG(Allschwil，Switzerland)公司动力学试剂盒测定。

统计学方法

分析ACE I/D基因多态性与骨丢失关系时，根据不同基因型将受访者分为三组；分析血清ACE活性与骨丢失关系时，根据血清ACE活性的四分位数将受访者分为四组。连续变量表示为均数±标准差(x±s)，分类变量表示为数值(频数)。连续变量采用单因素方差分析，分类变量采用卡方检验。采用多元回归分析法分析ACE I/D基因多态性及血清ACE活性与骨丢失的相关性。那些在单因素方差分析和卡方检验中P值小于0.1的变量被选为混淆变量纳入多元回归分析。本研究采用SPSS软件11.0进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

ACE I/D基因多态性与骨丢失的关系

共有1582例男性受访者和1730例女性受访者被选来分析ACE I/D基因多态性与骨丢失的关系。其中男性受访者II、ID、DD基因型人数分别为693、733和156例，女性受访者II、ID、DD基因型人数分别为794、740和196例。临床特征统计显示，除男性受访者的体质量指数(body mass index，BMI)和女性受访者的年龄(P＜0.1)，其他临床特征和药物使用在男女受访者的不同基因型之间没有显著差异(表 1和表 2)。校正混淆因素后，没有发现ACE I/D基因多态性与骨丢失存在相关性(表 3)。

血清ACE活性与骨丢失的关系

1 119例男性受访者和1 067例女性受访者被选来分析血清ACE活性与骨丢失的关系。男性受访者血清ACE活性四分位数组从低到高分别为263、301、278、277例，女性分别为265、274、255、273例。临床特征统计结果显示各亚组比较，男性受访者体质量和女性受访者糖尿病存在统计学差异(P＜0.1)(表 4和表 5)。校正混淆因素后，多元回归分析结果显示，男性和女性受访者血清ACE活性与骨丢失没有相关性(表 6)。

讨论

本研究结果显示ACE I/D基因多态性、血清ACE活性与中国老年人的骨丢失没有相关性。既往有报道，ACE I/D基因多态性对血清ACE活性具有较大影响，这可能与局部血管紧张素Ⅱ浓度相关。此外，ACE I/D基因多态性还与血清缓激肽浓度相关。早期的研究显示，血管紧张素Ⅱ能够刺激新生大鼠锁骨成骨样细胞的增殖，而抑制成骨细胞的分化和矿化。然而，Hatton等发现血管紧张素Ⅰ和血管紧张素Ⅱ是破骨细胞骨吸收的强刺激剂。一项体外研究结果显示，血管紧张素Ⅱ通过上调成骨细胞RANKL的表达间接促进破骨细胞的分化和激活。有报道缓激肽能够刺激骨吸收和降低骨密度。由于ACE I/D基因多态性与局部血管紧张素Ⅱ浓度和缓激肽浓度相关，其应该会对骨丢失有作用。可本研究结果显示ACE I/D基因多态性与骨丢失没有相关性，可能的原因是尽管ACE I/D基因多态性对血清ACE活性有较大影响，但是同样基因型的受访者中，血清ACE活性的变化较大，这可能减弱了ACE I/D基因多态性与骨丢失的相关性。

从本研究中，可以推测肾素血管紧张素系统对骨健康的作用可能相对较弱，尽管ACE I/D基因多态性对血清ACE活性具有较大影响，由于同样基因型受访者间血清ACE活性变异较大，这使得ACE I/D基因多态性与中国老年人的骨密度和骨丢失之间没有显著相关性。最近有研究报道，ACE I/D基因多态性与土耳其人的骨质疏松存在相关性。然而，另一项研究显示在西班牙人，ACE I/D基因多态性与骨质疏松性骨折的发生率没有相关性。可见，ACE I/D基因多态性与骨健康的关系可能存在人种差异，需要进一步的研究阐述。

有报道显示血管紧张素Ⅱ对骨健康存在不利作用，而ACE的主要作用是将血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ。因此，ACE I/D基因多态性、血清ACE活性与骨丢失无关，可能的原因是肾素血管紧张素系统对骨的作用较弱，而肾素血管紧张素系统的个体差异导致不同的血清ACE活性组之间的骨丢失没有差异。

目前，关于肾素血管紧张素系统与骨健康的关系仍不十分一致。在Mr.OS队列研究中，发现ACE抑制剂的应用能够增加中国老年人的骨丢失。继续分析了多中心研究的美国中心数据，得出了同样的结论，ACE抑制剂的使用与美国人的骨丢失正相关，而血管紧张素受体拮抗剂与骨丢失没有相关性。然而，在美国的另一项队列研究(SWAN队列研究)中，发现ACE抑制剂的使用不能够增加患者的骨密度。如果考虑到骨折发生率，结果同样不一致。有研究报道使用降压药，特别是ACE抑制剂，增加了韩国人的骨折风险，但是使用ARB并没有增加骨折的风险。然而，来自Mr.OS的结果显示，ARB的使用与非椎体骨折的发生率呈负相关，而ACE抑制剂的使用与非椎体骨折的发生率没有关系。同样有研究报道，ACE抑制剂和ARB的使用对骨折发生率没有差异。

有趣的是，实验室研究同样存在不同的结果。一些研究报道，ACE抑制剂的使用对骨健康有益，其主要通过ACE-2/Ang1-7/Mas通路经血管紧张素Ⅱ 2型受体起作用。然而，最近一项研究报道，卡托普利通过刺激破骨活性和抑制成骨活性而对骨量起到有害作用。除了肾素血管紧张素系统，激肽释放酶—激肽系统同样在骨代谢中起作用。此外，除了经典的肾素血管紧张素系统，局部肾素血管紧张素系统同样对骨健康有作用。综合所有这些结果，为了阐明肾素血管紧张素系统与骨健康的关系，仍需要进一步研究。

本研究的优势是样本量大，受访者无特殊选择的背景以及矫正了较多的混淆因素。本研究的不足包括研究主要针对中国老年人，药物使用时间并不十分准确而且没有剂量的数据。尽管本研究结果显示，ACE I/D基因多态性及血清ACE活性与中国老年人的骨丢失没有相关性，但相信本研究结果对于阐明肾素血管紧张素系统与骨健康的关系仍具有一定意义。