作者：张浩 汪纯 岳华 顾洁梅 胡伟伟 何进卫 傅文贞 魏占英 章振林

单位：上海交通大学附属第六人民医院骨质疏松和骨病专科 骨代谢病与遗传研究室

摘要：目的  观察123个汉族成骨不全(osteogenesis imperfecta，OI)家系中存在表型不一的家系比率，并探讨导致同一突变不同表型的潜在机制。方法  分析123个汉族OI家系(包括以往研究的117个家系)中存在表型不一的家系比率。用单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)SNaPshot分型技术检测21个家系先证者及其表型不一家系成员的血液和口腔黏膜的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)中COL1A1和COL1A2基因21个SNP位点的分型，从而检查体细胞样本的嵌合率。同时检测2个存在COL1A2基因同一突变(c.1009G＞A)家系的甲基化程度差异。结果  在123个OI家系中，21个(17.1%)家系存在表型不一，仅1例先证者的父亲显示体细胞基因镶嵌，其血液中有43.1%突变等位基因，口腔上皮细胞有39.6%的突变等位基因。在2个存在COL1A2基因同一突变(c.1009G＞A)的家系中，2例先证者的甲基化程度均高于其母亲。结论  国人OI家系内COL1A1和COL1A2基因同一突变发生不同表型的比率为17%。在这21个表型不一的家系中只有1例(4.8%)先证者的父亲存在体细胞镶嵌。甲基化程度可能与表型严重程度有关。在遗传咨询时，对先证者无临床表型的家属进行致病基因的突变检测是十分必要的。

关键词：成骨不全；COL1A1；COL1A2；突变；不同表型

成骨不全(osteogenesis imperfecta，OI)是一种以骨脆性增加为特征的遗传性骨病，骨折为其主要临床表现，还包括一些结缔组织异常，如蓝巩膜、牙本质发育不良以及身材矮小等。在一些研究中，OI的表型十分多变，经典OI分型为4型。OI病情的严重程度差异极大，表型从围产期致死型到轻型的偶尔骨折，有些病例甚至一生都无明显症状。有90%的OI患者具有编码Ⅰ型胶原的Ⅰ型胶原α1链基因(COL1A1)或Ⅰ型胶原α2链基因(COL1A2)的突变。同一基因型突变有不同的临床症状是其多变表型，OI家系间或家系内同一突变多变表型的现象较多见。早在1984年，Sippola等描述了一个三代都有OI的家系，该家系中有9例基因突变者，其表型从仅有身高变矮及蓝巩膜到伴随多发骨折。不同家系的表型多变可以解释为不同的环境因素对COL1A1或COL1A2基因突变的影响。而家系内的表型多变，可以用COL1A1或COL1A2基因同一突变表达差异解释，其中突变体细胞或生殖细胞存在基因镶嵌是原因之一。Pyott等观察到致死型OI的反复发生，就是由于双亲之一存在显性突变的基因镶嵌所导致。因此，了解OI的表型多变有助于该疾病的产前诊断，尤其对于患儿无症状的父母进行基因突变的检测，可以预测其后代中OI的再发率。迄今，只有少数OI家系研究报道了OI患者的表型多变，这些研究往往是对单个家系OI患者的家系内表型多变进行描述，很少有在多个OI突变家系中进行表型多变比率的报道。在中国，尚无有关OI患者表型多变比率的具体数据，也没有OI突变体细胞基因镶嵌的研究。2002年至2016年, 笔者总结了123个COL1A1或COL1A2基因突变OI家系的表型和基因型，其中包括117个笔者以往研究中的家系，观察在同一家系中相同突变家系成员存在不同表型的现象。本研究探讨在123个中国OI家系中存在表型不一的家系比率以及探讨导致同一突变不同表型的潜在机制。

对象与方法

对象

本研究纳入上海交通大学附属第六人民医院骨质疏松和骨病专科从2002-2016年收集123个OI家系，其中包括以往研究的117个家系。总共收集了622份外周血基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)样本，包括了123例先证者，249例家庭成员，250例健康对照组。其中对21家COL1A1或COL1A2基因突变导致的OI表型多变的先证者和家系成员用口腔黏膜脱落细胞采集棒刮取口腔黏膜。对照组样本测序评估突变位点是否只是单核苷酸多态性。记录患者的临床特征，包括巩膜颜色、是否存在牙本质发育不良及听力下降、骨折史、身高、体重及OI临床分型。OI临床分型按照Sillence分型标准。所有患者的父母非近亲婚配，也未曾用药治疗。本研究经上海交通大学附属第六人民医院伦理委员会批准。所有成人参加者均签署知情同意书，未成年人则由其父母代理签署知情同意，该知情同意程序经上海交通大学附属第六人民医院伦理委员会批准。

Ⅰ型胶原基因突变分析及基因镶嵌检测

COL1A1和COL1A2基因所有外显子的突变，包括外显子—内含子交界处，均用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增，与笔者以往研究一致。COL1A1和COL1A2基因组序列(AF017178.2和AF004877.1)和编码核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)序列(Z74615.1和Z74616.1)作为参考序列。使用美国应用生物公司(ABI)的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)SNaPshot?分型技术对21个家系先证者及其表型不一的家系成员的血液及口腔黏膜DNA进行突变位点体细胞镶嵌检测，以及该突变位点在样本中检测到的比例。用Primer3软件设计引物(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。用Qiagen公司的HotStarTaq进行位点特异性PCR。ABI3130XL测序仪上收集的原始数据用GeneMapper 4.0(Applied Biosystems Co., Ltd., USA)分析。]]>

甲基化分析

本研究中2个表型变异的家系均为COL1A2基因的c.1009 G＞A突变，而且这个突变位点也是COL1A2基因的甲基化位点，检测这4例研究对象的甲基化程度。COL1A2基因启动子5000及第一外显子和第一内含子处找到一段240 bp的CpG岛，同时对突变位点c.1009G＞A也进行甲基化程度测定。使用重亚硫酸盐扩增测序进行定量检测甲基化(BiSulfite Amplicon Sequencing，BSAS)，使用EZ DNA甲基化金试剂盒(ZYMO，CA，USA)进行重亚硫酸盐处理1 μg基因组DNA。处理后DNA的目标CpG区域随后扩增(HotStarTaq polymerase kit，TAKARA，Tokyo，Japan)构建文库，PCR产物随后净化并用Illumina NextSeq 500(Illumina，San Diego，CA，USA)测序。每个CpG位置的甲基化水平用测得甲基化胞嘧啶在总的测定胞嘧啶中的百分比计算。

统计学方法

用配对样本t检验比较2例先证者及各自母亲COL1A2的甲基化水平。由于一共只有4个样本，所以将2例先证者作为一组，2例母亲作为一组，做配对样本t检验。数据用SPSS Statistics Version 22.0(Armonk，NY：IBM Corp.)分析。双侧t分布P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

研究对象的临床和遗传特征

共123例先证者有COL1A1或COL1A2基因突变，其中93例COL1A1突变，30例COL1A2突变。男性76例，女性47例，年龄0.4~65(17.1±13.4)岁。依据Sillence分型，75例(61.0%)Ⅰ型OI，25例(20.3%)Ⅲ型OI，23例(18.7%)Ⅳ型OI，无Ⅱ型OI(表 1)。

表型多变的OI家系临床和遗传特征

123个OI家系中，21个(17.1%)存在表型多变。在这21个OI家系中，家系成员与先证者均有同样的突变(13个家系为COL1A1突变，8个家系为COL1A2突变)，但6个家系成员仅有蓝巩膜，4个家系成员仅有身材矮小，3个家系成员仅有蓝巩膜和身材矮小，1个家系成员仅有牙本质发育不良和身材矮小，1个家系成员有蓝巩膜、牙本质发育不良和身材矮小，另外6个家系成员无任何OI的临床表现。这些家系成员与先证者的关系包括13位父亲、6位母亲、1位女儿和1位姐姐。这21个家系的先证者均有骨折史，其中5例先证者有10次以上骨折史(表 2，表 3)。另外，在首次就诊后3年，对表 2中家系2先证者进行电话随访，获知其同样突变的女儿已经8岁，从未发生骨折，身高120 cm，与同龄女孩相当，而且能跑和跳，与正常孩子活动能力无明显差异，而该先证者曾在4岁时双小腿及前臂骨折。

依据Sillence分型，21个OI家系中66.7% (14/21)先证者临床诊断Ⅰ型OI，19.0%(4/21)先证者临床诊断Ⅲ型OI，14.3% (3/21)先证者临床诊断Ⅳ型OI (表 2，3)。21例先证者突变类型包括13例错义突变，1例无义突变，1例缺失突变，5例剪接突变和1例移码突变，大部分是甘氨酸置换突变和剪接变异。

在这21个家系中只有1个家系(4.8%)先证者的父亲存在基因镶嵌(家系11)，该家系突变位于COL1A1基因的c.2335G＞A。基因镶嵌程度在血液和上皮细胞DNA中不同，突变比率在血液DNA中约43.1%，在口腔黏膜DNA中约占39.6%。

2个家系先证者及其母亲的甲基化程度

比较有COL1A2基因相同突变c. 1009 G＞A 2个家系先证者和各自母亲在COL1A2基因上每个CpG部位的甲基化程度。其中2例先证者的甲基化程度分别为(47.98%和48.59%)，平均48%；2例先证者母亲的甲基化程度分别为(41.76%和43.26%)，平均为43%，2例先证者均较其母亲在COL1A2基因c. 1009 G＞A突变位置上甲基化程度更高(P=0.019)。在COL1A2基因启动子5000及第一外显子和第一内含子处一段从基因组94023797到94024073240bp的CpG岛中，2个家系中先证者和母亲甲基化程度无差别。

讨论

同一家系相同OI突变者的临床表型多变早在80年代就被报道，Kuivaniemi等报道了一例成纤维细胞合成Ⅰ型胶原α2链变短的OI男孩有多发骨折及大关节脱位，而他的母亲有同样的基因突变却无任何症状。Byers等发现一例新生儿致死型OI的父亲表现为Ⅳ型OI，并发现父亲或母亲性腺镶嵌(gonadal mosaicism)也可以导致反复出生OI患儿。本研究观察到在123例OI家系中，17%有家系内表型多变。在这些表型多变的家系成员中，约有71.4% (15/21)的家系成员没有骨折史，只有轻微表型如蓝巩膜、牙本质发育不良或身材矮小，而剩余的28.6%(6/21)的家系成员无任何OI临床症状。提示OI患儿的父母无临床表型也不能排除父母是基因突变的携带者，正确的产前诊断指导可降低OI患儿出生的风险。在中国，OI不同表型的比率并不低，这个现象应该值得重视。表型多变的OI家系与先证者的临床严重程度无关。在本研究中，表型多变家系中的先证者临床诊断分型包括了OI Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型。本研究病例中缺乏Ⅱ型OI患者，这可能是因为患者都来自门诊存活的病例，而那些新生儿期已死亡的病例未能纳入。

没有症状或症状轻微的父母有较严重临床表现的OI患儿可能归因于父母之一有种系或体细胞的基因镶嵌(germline or somatic mosaicism)。Edwards等报道了一例男性与不同女性均育有致死型OI，经检测发现其同时具有种系及体细胞镶嵌，在COL1A2基因上有突变。Pyott等同样发现具有基因镶嵌的父亲或母亲往往表型正常，因此不会意识到会有OI患儿出生的风险。而且，他们发现家庭中如果第一个孩子是致死型的OI，其父亲或母亲有基因镶嵌的比率可能达到16%(6/37)。本研究显示表型变异的家系都是两代人，因此OI的基因镶嵌不能排除。检测体细胞基因镶嵌往往需要2种不同来源的DNA(如血液DNA和上皮细胞DNA)。本研究在21个表型多变家系中，只检测到1个家系(4.8%)先证者的父亲具有体细胞基因镶嵌，在血细胞DNA中突变比率为43.1%，在口腔黏膜上皮细胞中DNA突变比率为39.6%。

在OI病例中，Ⅰ型胶原α1链甘氨酸残基上同样的替代突变导致不同表型也被归因于随机效应或未知的基因调节修饰。为了探究胶原基因突变外显不全及多变表型的原因，Pereira等检测一组纯系缺失COL1A1基因的转基因鼠，在胚胎期就观察表型使得环境因素最小化，这样就可以在同性质的遗传背景下研究骨折表型的遗传。有趣的是，结果显示表型变异是胶原基因突变的固有特征，不能用遗传背景变异或基因表达水平不同解释。近期的研究显示，一些基因突变导致的个体表型差异主要是由于DNA甲基化和(或)组蛋白修饰导致的。本研究中，两个具有COL1A2基因相同突变家系的先证者较他们症状轻微母亲的突变位点甲基化程度更高。巧合的是，COL1A2基因突变位点c. 1009 G＞A中c. 1009 G正好参与构成基因甲基化。由于COL1A2基因的突变是杂合突变，因此完全甲基化程度也只有50%，而先证者显示48%甲基化程度较其母亲43%的甲基化程度高。甲基化程度的不同可能促成了同样突变OI的不同表达。然而，本研究只有2个具有同样基因位点突变表型不一的家系，统计效力较弱，在今后的研究中需要更多该位点突变的表型变异家系验证该位点甲基化程度在OI表达中的作用。

单基因疾病的表型可以受到基因特异性相互作用伴侣的影响，也可以受到翻译调节的影响，如基因修饰和非编码RNA等。Ahluwalia等推断与目的基因结对的微小RNA共表达也可以解释外显不全和表达变异的机制。某些顺式或反式作用因子可影响突变基因的表达，使得其突变表型更轻微, 如反式作用调节剂(如CNOT3)可减轻PRPF31基因突变导致的常染色体显性色素性视网膜炎的表型。Rose等认为表型外显率作为一种多基因性状进行研究似乎更合适，主要风险等位基因和许多较小的位点相互作用进而确定单基因突变的临床表现。另外一些原因也可能导致较宽广的临床表型谱，例如年龄依赖性的症状变化、第2次突变等。以上所述均可能是本研究中另外18个家系内表型多变的原因，将在未来的研究中进一步去证实。本研究结果可能有益于临床实践，它们提示在OI家系中没有骨折史的家族成员并不能排除OI，如果可能，OI先证者的家系成员也应该进行基因筛查。

本研究显示，在123例OI家系中17%有家系内表型多变。这些OI先证者的家系成员虽然与先证者有同样的突变，但他们表型轻或者无任何临床症状。家系内表型多变的发生独立于先证者表型的严重程度。在这些表型多变家系中，只有1例(4.8%)先证者的父亲显示体细胞基因镶嵌。甲基化程度的不同可能促成了同样突变OI的不同表达。提示在遗传咨询时，对先证者无临床表型的家属进行致病基因的突变检测也十分必要。因此，建议遗传检测最常见的致病基因COL1A1和COL1A2作为诊治OI的重要部分。遗传研究将有助于产前诊断预防再次出生OI患儿，尤其对于有过OI孩子的无症状父母。