作者：史宏利 姜鑫 程群

单位：复旦大学附属华东医院骨质疏松科 年医学研究所骨代谢研究室

摘要：骨质疏松症已成为威胁中老年人健康的主要疾病之一。骨代谢在维持骨发育、骨修复中具有重要的作用。骨组织内的细胞通过多种不同的方式相互作用，如直接接触、分泌旁分泌因子、细胞与骨基质之间相互作用等，共同维持骨代谢平衡。近几年来，外泌体作为一种细胞之间的交流方式，开始受到人们广泛的关注。本文主要就骨代谢中外泌体的研究进行综述，为骨质疏松症提供潜在的以细胞为基础的治疗新途径。

关键词：骨质疏松症；骨代谢；外泌体；成骨细胞；破骨细胞

细胞外囊泡(extra-cellular vesicles，EVs)，包括外泌体，是来源于细胞的颗粒物，包含了大量蛋白质和核酸类物质，可以调节局部或者远端靶细胞，进而发挥其生物学作用。大量研究发现外泌体在骨代谢中发挥重要的作用。这种通过外泌体发挥作用的细胞间交流方式可能作为新的研究方向和骨质疏松症等疾病的治疗靶点，为生物医学工作者提供新的思路。

外泌体的生物学特性

外泌体大小20~100 nm，外膜由保护性的脂质双分子层组成，内包含有可溶性的生物活性物质和膜结合蛋白质、脂类、代谢物、DNA和RNA(mRNA、miRNAs和其他小的调节RNA等)。在大多数体液如外周血、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁、脑脊液、关节液、支气管肺泡灌洗液等体液中可检测到。外泌体具有保护外泌体内容物，防止分泌后降解的功能。外泌体通过向内出芽的方式形成多囊泡小体(multivesicular bodies，MVBs)。MVBs在Rab-GTP酶(如RAB11，RAB35，RAB27a和RAB27b等)的调节下，与供体细胞膜融合，随后外泌体被释放进入细胞内环境，进而通过多种方式对靶细胞发挥作用，包括配体受体方式的结合，直接膜与膜之间的融合，吞噬吞饮作用和网格蛋白介导的内吞等。尽管外泌体通过多种不同的方式作用于靶细胞，但相关的调节机制尚不明确。

研究发现，外泌体内的一些相对特异的蛋白质如TSG101和CD63等可以作为外泌体的标志物，用来分析外泌体分离的纯度，也可通过相应的免疫机制帮助提纯外泌体。不同细胞来源的外泌体具有不同的生物学功能，在靶细胞的增殖、凋亡、分化、内分泌、转移等方面发挥不同的作用。

外泌体与肿瘤骨转移

近年来，肿瘤微环境受到人们广泛的关注，Mirjam等在乳腺癌的研究中发现肿瘤周围的基质细胞通过分泌外泌体影响肿瘤的转移，增殖以及对于放化疗的抵抗等，这些发现为肿瘤的靶向治疗提供了新的方向。而骨骼转移性疾病是许多原发部位肿瘤细胞播散的严重并发症，如多发性骨髓瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等。

多发性骨髓瘤与破骨细胞

在多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)溶骨性病变中，破骨细胞(osteoclasts，OCs)功能改变发挥了最主要的作用。美国学者Raimondi提出MM中微环境的改变，影响OCs的功能，并且证实：不论是MM细胞株还是患者的骨髓瘤细胞，其分泌的外泌体明显地影响了小鼠和人破骨前体细胞(osteoclastprecursors，pOCs)的迁移、OCs的分化与功能。破骨细胞分化相关的基因CTSK、MMPs、TRAP等都明显上调，荧光染色肌动蛋白环形成以及骨吸收陷窝增加。值得注意的是，MM外泌体对于OCs的增殖没有作用，但可以抑制pOCs的凋亡，增加细胞存活率。这一发现提示可以通过影响MM的微环境，将外泌体作为研究重点，改善因MM而引起的骨溶解作用。然而研究者还没有揭示MM分泌的外泌体是如何对OCs发挥作用的，其机制尚有待进一步研究。

前列腺癌与成骨细胞、OCs

前列腺癌骨转移患者成骨活性明显增高，是一种病理性的骨代谢，正常骨结构受到破坏。Ye等发现前列腺癌细胞MDAPCa 2b分泌的外泌体内的miR-141-3p促进OCs的活动，如增殖、钙盐沉积、骨保护素(osteoprotegerin，OPG)分泌等。同时在小鼠体内也证实了相应的结果。

与前者不同的是，在Karlsson等研究前列腺癌中OCs的功能发现，抗凋亡标记物Bcl-2和凋亡激活蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bax)作为细胞凋亡的标记物，在外泌体干预后并没有明显的变化，但其对OCs增殖的抑制作用很明显，而且发现低剂量的外泌体干预后OCs数量虽没有明显的变化，但细胞体积变小，且胞内核数量减少。外泌体作为一种新的转移媒介，在前列腺癌中影响成骨细胞及OCs的功能，调节肿瘤微环境，影响前列腺癌骨转移。

外泌体在肿瘤的发生发展中发挥非常重要的作用，肿瘤细胞外泌体在骨细胞的增殖、分化和凋亡等不同阶段发挥着作用。现如今有关癌症细胞对骨细胞作用的相关研究很有限，也提示可以在外泌体这个研究方向关注肿瘤对骨代谢的影响，早期发现和预防肿瘤相关的骨代谢并发症，提高患者生存质量。

外泌体与骨代谢

骨组织相关细胞的外泌体内容物分析

外泌体内包含有蛋白质、脂类、代谢物、DNA和RNA(mRNA、miRNAs和其他小调节RNA)等多种物质。就外泌体内物质分析研究有助于预测疾病发生发展转归，也可以通过对相关机制的研究，针对发病机制的信号通路和致病因子研发干预药物。

成骨细胞外泌体组蛋白分析：Ge等就小鼠成骨细胞株MC3T3外泌体做蛋白质组学分析中，发现了1 069个蛋白质，在对其功能做富集分析，研究者就感兴趣的三方面总结发现：(1)生物学过程：生物学过程主要集中在蛋白定位和细胞内信号通路。就细胞内信号通路而言，Integrin信号通路和mTOR信号通路引起了关注，α5β1 integrin促进间充质干细胞成骨向分化，而mTOR信号通路也在骨代谢平衡中发挥了很重要的作用。(2)细胞组成：外泌体内的蛋白主要集中于胞膜和胞浆。进一步证实外泌体蛋白质来源于母细胞，并可能代表了母细胞的一些生物学功能。(3)分子功能：分子功能主要集中在核苷酸结合和结构分子活性。其中，Rho GTP酶受到了关注，研究发现Rho GTP酶在骨重塑中起到很重要的作用。成骨细胞来源的外泌体在调节成骨细胞的分化和骨重塑方面发挥了很重要的作用，研究者通过分析小鼠成骨细胞外泌体内蛋白质组学，发现了潜在的与成骨相关的蛋白质和信号通路，为以后骨代谢相关的研究提供了丰富的蛋白质数据资源。

骨细胞外泌体microRNA分析：日本学者MARI SATO等构建了一种缺乏骨细胞(osteocyte-less，OL)的小鼠模型，分析OL小鼠与野生型小鼠(Wide type，WT)血清外泌体内microRNA的差异，同时也分析了骨细胞系MLO-Y4与对照组ST2成骨前体细胞上清外泌体内microRNA的差异。研究发现，在OL小鼠血清中下调的12个miRNA(miR-3473a、miR-3473b、miR-3473e、miR-5128、miR-6244、miR-6239、miR-5132-5p、miR-705、miR-208a-5p、miR-3104-5p、miR-1224-5p和miR-5621-5p)中，有11个在骨细胞MLO-Y4外泌体中上调。提示骨细胞分泌的外泌体可能进入血液循环中发挥一定的生物学功能，同时可以将血液中外泌体内相关microRNA作为生物标志物biomaker，分析骨代谢中骨细胞的功能。

骨髓间充质干细胞成骨向分化过程中外泌体内microRNA与mRNA的分析：人骨髓来源间充质干细胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hMSC)具有多向分化的潜能，在不同条件下可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞等多种细胞。

Xu等对MSC成骨向分化过程中microRNA的变化做了分析，检测到79种miRNA，其中有9个明显上调的miRNA，let-7a、miR-199b、miR-218、miR-148a、miR-135b、miR-203、miR-219、miR-299-5p、miR-302b和5个下调的miRNA，miR-221、miR-155、miR-885-5p、miR-181a、miR-320c。研究者通过DNA智能分析(DNA Intelligent Analysis，DIANA)microRNA在通路中的组合效应，发现改变主要集中在与成骨分化过程有关的生物素代谢、RNA降解、mRNA监视通路、WNT信号通路、紧密连接、B细胞受体信号通路、脂肪细胞因子信号通路、黏合连接、白细胞跨内皮迁移、RNA转运等。且有研究报道，以上改变的miRNA与骨代谢、成骨细胞分化、矿化等相关。此外，研究者对外泌体内的mRNA做了分析，结果发现，7个mRNAs(RPS2、DGKA、ACIN1、DKK2，Xsox17、DDX6和Lsm2)随着时间改变有表达差异，有两个NFkB相关基因，包括ADAM17和NFKB1，在外泌体中表达下调。

外泌体内的miRNA和mRNA在hMSC成骨向分化，细胞与细胞之间的交流以及骨代谢方面发挥了很重要的作用。microRNA作为内生非编码RNA，通过靶向mRNA阻止转录，降低蛋白水平。已成为各种生物和病理过程的关键负向调控因子，包括发育时间、器官发生、细胞凋亡、细胞增殖和分化和肿瘤发生的控制。研究者第一次将人BMSC上清外泌体分离出来，并且揭示了成骨向分化过程中随时间变化的microRNA以及mRNA的改变，分析了相关的信号通路。有助于未来的临床研究及疾病预防。

细胞内包含有蛋白质、脂类、microRNA、mRNA等多种不同的物质，而不同细胞来源的外泌体内容物具有不同的生物学功能。就骨组织相关细胞外泌体内容物的分析而言，研究还非常有限。此外，一些研究仅局限于对动物来源的细胞外泌体的研究，尚没有对人相关外泌体内容物的分析及不同种属来源外泌体内容物的比对。尚不能用动物来源的外泌体阐释与人相关的疾病发生发展机制。

外泌体介导microRNA对骨组织内细胞的作用

骨组织中，细胞之间通过不同的方式相互作用，共同维持骨代谢平衡。骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，反过来，矿化成骨细胞分泌的外泌体又可以诱导骨髓间质干细胞分化为成骨细胞，在骨代谢中形成一种正反馈通路。成骨细胞分泌M-CSF、OPG等，作用于破骨前体细胞受体，影响OCs分化。而OCs来源的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、Sema4D等又可影响成骨细胞生物学功能。microRNA在OCs、成骨细胞骨代谢中具有很重要的作用，外泌体作为一种细胞间的交流方式，可以介导microRNA在细胞之间的交流作用。

OCs来源外泌体内miR-214-3P对成骨的作用：2016年，Li等提出OCs来源的外泌体miR-214-3P抑制成骨细胞骨形成。研究者建立了OCs特异性高表达miR-214-3P的基因小鼠模型，进行了一系列体内体外实验，证实外泌体介导破骨对成骨的作用。研究者通过antagomiR-214-3p抑制OCs破骨细胞作用，促进骨形成，增加老年OVX鼠骨量。同一年，Sun等也证实OCs来源的外泌体通过ephrinA2/EphA2识别成骨细胞，外泌体内的miR-214作用于成骨细胞，影响成骨细胞的功能。此外，研究者分析了骨质疏松与非骨质疏松患者血清外泌体外泌体内miR-214的水平，两者之间具有显著性的差别。提示血清中的miR-214水平可能作为一种诊断骨质疏松的生物标记物，同时也可以作为潜在的治疗性靶位，为骨质疏松症的治疗提供一种新型的研究方向。

骨细胞来源外泌体内miR-218对成骨的作用：在肌肉—骨之间联系的研究中发现，肌肉生长抑素干预骨细胞osteocytic (Ocy454)后，Ocy454分泌的外泌体内miR-218下调，经成骨细胞MC3T3摄取后，成骨细胞内RUNX2表达明显下调，且通过抑制Wnt信号通路而影响成骨细胞分化，进而负性调控骨代谢。

间充质干细胞来源外泌体内不同microRNA对骨折愈合的影响：研究发现，间充质干细胞来源的外泌体可以促进骨折愈合，而人骨肉瘤细胞株HOS来源的外泌体却没有类似的效果，对比两者之间microRNA的改变，发现间充质干细胞外泌体中miR-4532、miR-125b-5p和miR-338-3p等高表达，而这些microRNA在组织修复、骨折愈合中的作用尚不明确，提示可能有一些新型的microRNA在骨折愈合中发挥着积极的作用，通过研究相关机制，有助于骨相关疾病的治疗以及作为一种新型的生物标记物，早期发现疾病以及预测疾病的发生发展与转归。

外泌体作为siRNA和miRNA的有效携带者，有可能作为一种潜在的RNA传递物，在治疗多种疾病及组织重塑中发挥重要的作用。对不同细胞来源的外泌体内容物分析可能为组织修复等提供一种新型的机制与方向。

总结

外泌体为细胞之间的相互作用提供了一种新的研究方向，它通过运输蛋白质，脂质，核酸等发挥其生物学作用。在癌症中，不论是肿瘤转移、增殖、凋亡、对于药物治疗的抵抗等，外泌体都发挥了很大的作用。而在骨代谢方面，相关的研究还很少，有限的研究虽然发现外泌体在骨代谢方面发挥了一定的作用，但缺乏相关机制及在体的研究。此外，有研究发现间充质干细胞来源的外泌体可促进血管发生，而骨血管发生对骨重塑具有重要作用。间充质干细胞来源的外泌体是否对骨代谢相关细胞有直接作用，又或者通过血管的间接作用影响到骨代谢，PTH作为骨质疏松的关键性药物，是否也在外泌体的形成、分泌、摄取及发挥功能方面有一定的作用，这些问题都值得深入研究，为及早发现骨代谢相关疾病的病理生理机制，寻找到有效的干预靶点，以及评估疾病疗效提供依据及方向。