作者：程强 刘刚

单位：南京大学医学院附属金陵医院骨科

摘要：微小RNA（microRNA）是一类非蛋白质类的新型基因表达调控因子。研究发现，miRNA在软骨代谢性疾病发展过程中发挥了重要作用。本文就miRNA生物特性及作用机制，软骨相关miRNA以及骨关节炎相关miRNA的研究进展做一综述。miRNA在软骨发育以及骨关节炎发生、发展过程中参与调节细胞内多种信号通路与炎性因子的表达，部分具有特异性，因此，某些特异性miRNA可以作为疾病的诊断标志物以及治疗靶点应用于临床中。

关键词：微小RNA；软骨代谢；细胞分化；信号通路

软骨细胞是构成关节软骨的唯一细胞成分，与Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ型胶原蛋白以及蛋白聚糖一起构成软骨组织，如发生原发性或继发性疾病导致软骨细胞变性或凋亡，可引发软骨下骨质硬化及边缘骨赘形成，导致具有关节功能障碍表现的骨性关节炎(osteoarthritis，OA)。微小RNA(miR，miRNA，microRNA)是一类广泛存在于动植物体内的非编码RNA，长度约20~22个核苷酸或21~25个核苷酸，可影响细胞增生、分化、凋亡及疾病进展。研究证明，许多miRNA在软骨代谢中起到了重要作用，本文就miRNA在软骨细胞以及OA研究进展作一综述。

MicroRNA产生途径及作用机制

miRNA的产生主要有3个途径：一是在细胞核内主要由RNA多聚酶2或者3转录产生Pre-miRNA，长度为几百到上千个核苷酸不等，通过加帽(Dicer)和poly-A尾部处理，被核糖核酸酶Ⅲ(Drosha)以及Dgcr8(Drosha的关键因子，miRNA加工蛋白)构成的复合物识别和分解，折叠形成一个发卡(hairpin)样结构，这一过程可被多个蛋白特异性调节，如hnRNPA1、p53、Smad以及Lin28；还有一种称为“mirtron”的途径，通过拼接方式产生发卡结构；第三种通过RNA聚合酶2直接转录而成，后两种方式产生的Pre-miRNA表达水平通常很低，其生物活性尚未完全明确。

miRNA通过一系列反应形成一种核糖核蛋白复合物称为RNA诱导的静默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)，多数情况下与mRNA特异性序列结合构成GW小体，通过腺苷酸乙酰化或者直接抑制翻译来调节目标mRNA，较少的情况下，miRNA可以与目标mRNA序列完全配对，激活Ago2活性降解mRNA，通过相关转录因子以及信号通路来调节细胞增生、分化甚至死亡。当miRNA-RISC与目标mRNA不完全配对时，可阻遏靶mRNA的翻译。一种miRNA可调控多种mRNA，多种miRNA也可以调控一种mRNA。

促进软骨分化相关miRNA

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)能够分化成软骨细胞，很大程度上依赖于miRNA。在此过程中，Dicer、Ago蛋白和DGCR8是miRNA发挥作用的必需酶，骨骼肌肉系统的Dicer和Ago缺乏会导致细胞分化异常，软骨细胞数量下降且分化成熟加速(表 1)。

miR-140表达于软骨细胞，位于WWP2序列，研究发现生成软骨的关键基因Y染色体性别决定结构域转录因子9(SRY-related high mobility group box gene 9，SOX9)能够调节WWP2表达，后者通过影响SOX9的转录活性来调节编码Ⅱ型胶原蛋白基因(collagen 2 alphal，COL2AL)的表达，在软骨细胞分化过程中发挥正向调节作用，SOX9及COL2AL在去分化软骨细胞中表达降低。组蛋白去乙酰化酶4(histone deacetylase 4，HDAC4)基因只在骨、软骨等少数组织中表达，如缺失会导致小鼠软骨过度转化为骨质而死亡，RUNX2是HDAC4作用的靶点，也是控制骨质硬化的基因，miR-140可通过HDAC4抑制RUNX2表达，避免软骨骨化。也有研究认为mi-140通过甲状腺激素相关蛋白(pthrp)/HDAC4通路确保HDAC4活性，促进软骨细胞分化。

Li等和Chen等发现miR-1可以显著诱导软骨细胞增生分化，直接调控HDAC4，负向调节RUNX2，抑制软骨细胞骨化，如敲除miR-1基因，可导致HDAC4表达抑制，但是过表达的miR-1可以抑制COL2AL和刺猬蛋白(sonic hedgehog，SHH)表达，SHH基因在胚胎阶段调控多种组织器官发育，在软骨成骨方面发挥了重要作用。miR-133通过负向调节RUNX2表达以及BMP/Smad信号通路，与miR-1作用途径类似。miR-23a家族(包括miR-27a，miR-24-2)通过下调骨架相关的特异AT序列结合蛋白2(special AT-rich sequence binding protein 2，SATB2)，抑制颗粒钙蛋白生成和软骨转化为骨。miR-203和在大鼠下颌骨髁突软骨细胞(mandibular condylar chondrocytes，MCCs)中表达平稳，可调控瞬时感受器电位离子通道4(transi-ent receptor potential vanilloid 4，TRPV4)以及脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)刺激MCCs产生的NO水平，维持软骨细胞内环境稳态。miR-222在关节软骨承重区域的表达远高于非承重区域，推测其可能参与调节了软骨机械传导通路。miR-206在E14.4小鼠软骨膜中高表达，在骨形成过程中表达逐渐降低，miRNA-335-5p在E13.5小鼠胚胎和颅面部软骨表达，均具有正向调节作用。miR-558在OA软骨中显著下降，miR-558通过抑制软骨细胞中COX-2以及MMP-13、MMP-1表达，维持软骨内环境平衡，减轻IL-1β诱导的炎性反应，MAPK以及NF-κB信号通路参与了这一过程。一些miRNA(miR-130b、miR-152、miR-28、miR-26b、miR-193b)作用于COL4A1，COL2A1和COL6A1等目标基因靶点，可促进间充质细胞分化形成软骨细胞。在此过程中，生长因子受体(growth factor receptor，GFR)、血管生成素1(angiogenin，ANG1)、胰岛素样生长因子2(insulin like growth factor 2，IGF2)受体、转化生长因子受体β(transforming growth factor-β，TGF-β)、IL-6，成纤维生长因子受体(fibroblast growth factor，FGF)、血小板来源生长因子A(platelet derived growth factor，PGFA)，信号转导因子Smad4，MAPK1，WNT以及基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)等均有参与，部分作用于Runx2的miRNA在软骨生成时高表达，随着向成骨细胞进一步分化，miRNA表达水平逐渐下降。

抑制软骨分化相关miRNA

miR-199a通过直接作用于转录因子Smad1来抑制早期软骨细胞分化蛋白，调节软骨生成。miR-199a-3p通过下调Smad来抑制早期软骨细胞分化。miR-204, miR-185，miR-199a-2-5p以及miR-214等转录后分别抑制Ang1、VEGF和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的表达，进而抑制软骨细胞分化。7类miRNA(23a、30c、34c、133a、135a、205、217)参与调节软骨基因GATA的转录因子TRPS1，抑制软骨细胞前体分化。miR23a和miR34a还是骨架相关的AT结合蛋白SATB2的转录因子，具有上调Runx2表达的作用，可能控制骨软骨前体阶段。Zhang等发现内源性miR-21在OA患者软骨组织中表达升高，其过度表达会抑制软骨生成，这一过程是通过作用于生长分化因子5(growth differentiation factor 5，GDF5)实现的。miR-101通过Sox9上调细胞外基质IL-6，Adamts-1, Adamts-5等表达，同时IL-1α、IL-2、IL-13、MMP-2、TIMP-2、TIMP-3、TGF-β2、TGF-β3和VEGF等表达水平升高，而使用miR-101抑制剂能够逆转上述炎性因子的表达，发挥细胞保护作用。过度表达miR-223导致人体关节软骨细胞的凋亡进而引起严重的关节损伤，miR-34a的上调能够激活Fas介导的终板软骨细胞凋亡，EphA5表达增加能够减少miR-34a在软骨细胞分化方面的抑制性作用，miR-145作用于ERG、CDK6、BMPR2等靶点，具有促进胚胎多能干细胞分化和抑制增生的作用；体外实验发现miR-145可下调软骨生成的关键因子SOX9，抑制软骨细胞增生分化。miR-9和miR-181可下调MMP-13水平，诱导Ⅱ型胶原蛋白表达，有利于促进软骨细胞分化并维持软骨完整性。但过表达的miR-181可以显著加重软骨损伤，对软骨生成有负性调节作用。

研究发现，体外培养软骨细胞存在去分化现象，细胞形态由多角形或圆形逐步向梭形转变，miRNA参与了去分化过程。miR-221和miR-222在软骨细胞去分化和再分化时均表达增加，miR-140在软骨细胞去分化时减少，miR-143和R-145也急剧减少，软骨细胞基因表达谱也发生变化，如Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和Y染色体性别决定SOX9基因表达下降，Ⅰ型胶原表达增加，但使用TGF-β刺激可恢复miR-143和miR-145表达(表 2)。

与OA相关miRNA

OA是软骨退化与修复之间的不平衡导致，基质金属蛋白酶家族ADAMTS5以及MMP-13是其中关键酶。在OA软骨细胞中，少数miRNA下调，miR-140，miR-146及miR-491上调，多数miRNA没有变化。下调的miR-27b直接调控MMP-13表达，miR-22水平与体质量指数(body mass index，BMI)有关，可引起炎性反应以及代谢变化，调节过氧化物酶体增生物激活受体ɑ(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)以及BMP-7的表达。miR-608或者miR-602抑制SHH表达，是重要的SHH转录后调节因子，IL-1β抑制miR-608和miR-602会导致OA中SHH和MMP-13的表达增加。醉茄素A可诱导兔关节软骨细胞COX-2剂量依赖性表达升高，伴有miR-25的过表达，抑制miR-25可以降低COX-2表达。miR-127-5p可以抑制软骨细胞中IL-1β诱导的MMP-13和其他某些因子如INK、NF-κB、MMP-1和COX-2的表达，但在OA软骨组织中miR-127-5p表达水平显著降低。关节炎患者关节软骨中miR-30b水平较正常人显著升高，使用miR-30b抑制剂能够提高聚集蛋白聚糖以及COL2A的表达水平，这一过程可能是通过转录因子ETS介导完成的。miR-125b在正常软骨细胞中表达高于OA，其过表达可以抑制IL-1β诱导的基质金属蛋白酶4(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4，ADAMTS4)产生，如miR-125b与ADAMTS4的3′UTR结合位点发生变异，则抑制效应下降。OA患者软骨细胞中miR-98的表达水平显著降低，过表达miR-98能够抑制软骨细胞的凋亡，可能是通过调节细胞和mRNA层次的bcl-2而实现的。Iliopoulos等发现miR-140在OA中表达水平显著降低，Miyaki等发现miR-140敲除小鼠的胶原蛋白聚糖流失和关节软骨纤维化较正常小鼠更快，并对蛋白聚糖以及2型胶原蛋白具有一定的耐受性。转基因小鼠软骨细胞中大量表达miR-140，可耐受抗原诱导的关节炎，表明miR-140可以对抗OA，miR-140敲除小鼠胚胎时期的骨骼生长基本正常，但是出生后由于软骨细胞增生分化能力下降导致骨骼短小，颅面部发育异常。Yang等发现miR-145在OA软骨细胞和受到IL-1β刺激之后表达增加，通过Smad3引起下游目标基因表达异常，导致OA软骨细胞外基质(extracellular matrix，ECM)降解。miR-146a在OA早期软骨细胞中高表达，但在严重OA中低表达，具有负性调节炎性反应以及内源性免疫反应的能力，可抑制破骨细胞，有利于维护软骨细胞稳态。miR-146与miR-140共同参与调节细胞因子信号通路，维持软骨合成与降解之间的平衡。miR-675与miR-140类似，在软骨细胞去分化过程中表达降低。

展望

随着对miRNA作用机制等相关研究的逐步深入，已经发现了一些在软骨分化过程中具有较强特异性的miRNA，可直接作用于Sox9、HDAC4、IGFBP5、COX2、COL2A1、Smad1、Runx2、GDF5等靶点调节软骨细胞增生分化，通过pthrp/HDAC4，BMP/Smad，MAPK，NF-κB等信号传导通路维持软骨细胞内环境的稳态，保持软骨基质合成与代谢之间的平衡。OA常伴随着合成代谢基因的变化(如COL2AI)，基因多态性在此过程中也有所体现，如GDF5和SMAD3都是OA风险等位基因，也是miRNA参与调节的靶点基因，因此OA与miRNA表达水平关系密切。

miRNA由于数量庞大，相互作用错综复杂，目前在软骨细胞分化及相关信号通路中的研究还不够深入，有必要进行软骨细胞特异性miRNA的功能、调控机制、作用靶点、作用剂量、活性因素、表达时序性等方面的研究，可以更好的了解软骨相关疾病的发病机制，提出新的诊断依据和治疗手段，指导软骨组织工程及软骨修复研究，最终用于临床实践，使患者受益。