作者：安方玉^1,2,3 颜春鲁^1,2,3 刘永琦^1,2,3 宋敏¹ 陈丽¹ 马正民¹ 牛彦强¹

单位：

1、甘肃中医药大学教学实验实训中心

2、甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室

3、敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室

摘要：目的 探讨左归丸对卵巢摘除大鼠钙磷代谢和细胞核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）/骨保护素（osteoprotegerin，OPG）的影响。方法 SD雌性大鼠60只，采用去卵巢法制备骨质疏松症大鼠模型，将大鼠分为假手术组，切除卵巢组，左归丸低、中、高剂量组，西药对照组（戊酸雌二醇片），每组10只。造模成功12周后给予药物干预，西药对照组给予戊酸雌二醇片0.09 mg/kg灌胃治疗，左归丸低、中、高剂量组按4.75、9.5、19 g/kg灌胃治疗，假手术组和切除卵巢组大鼠给予等体积蒸馏水灌胃，干预4周后股动脉采血处死大鼠。比色分析法检测血清钙（calcium，Ca）、磷（phosphorus，P）含量；ELISA法检测骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、细胞核因子κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor κB，RANK）和RANKL含量；双能X骨密度仪分析测定大鼠股骨的骨密度（bone mineral density，BMD）；AG-IX生物力学万能实验机检测最大载荷和弹性模量，比较各组间差异。结果 假手术组，切除卵巢组，西药对照组，左归丸高、中、低剂量组的BMD分别为（0.145±0.004）、（0.116±0.007）、（0.146±0.006）、（0.142±0.004）、（0.134±0.002）、（0.129±0.001）g/cm2；这6组的体质量分别为（173.20±13.92）、（264.10±28.61）、（249.44±26.64）、（243.00±10.25）、（253.45±18.19）、（268.50±22.39）g；这6组的子宫指数分别为（1.62±0.34）、（0.45±0.09）、（0.89±0.22）、（1.03±0.23）、（0.91±0.13）、（0.46±0.07）mg/g；这6组Ca、P含量分别为（2.07±0.07/0.30±0.02）、（0.92±0.08/0.10±0.03）、（1.89±0.11/0.22±0.03）、（1.95±0.13/0.27±0.02）、（1.67±0.10/0.19±0.06）、（1.59±0.15/0.12±0.02）mmol/L；这6组OPG、RANKL和RANK含量分别为（755.00±58.05/5.73±0.27/10.68±0.69）、（493.67±36.77/10.24±0.33/18.62 ±0.74）、（653.00±56.93/7.37±0.19/12.23±0.76）、（731.00±38.49/6.77±0.65/11.52±0.39）、（704.33±62.92/7.97±0.41/14.69±0.86）、（555.00±97.09/9.31±0.75/15.04±0.52）pg/mL；这6组的最大载荷分别为（142.16±0.10）、（86.26±0.13）、（126.43±0.31）、（119.77±0.74）、（111.96±1.57）、（98.92±1.44）N；这6组弹性模量分别为（19.48±0.24）、（13.10±0.43）、（16.70±0.37）、（16.17±0.15）、（15.99±0.22）、（14.98±0.15）MPa。与假手术组比较，切除卵巢组大鼠的BMD、Ca、P、OPG、最大载荷和弹性模量水平均显著降低，而RANK和RANKL含量均明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；与切除卵巢组相比，左归丸各剂量干预组和西药对照组大鼠BMD和弹性模量均显著升高，RANK和RANKL含量明显降低，左归丸中、高剂量组和切除卵巢+西药对照组Ca、P、OPG含量和最大载荷显著升高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。结论 左归丸能升高去卵巢大鼠的骨密度，提高骨强度，并改善其力学性能，其机制可能与调节RANKL/OPG水平和Ca、P代谢有关。

关键词：左归丸；去势大鼠；钙磷代谢；细胞核因子κB受体活化因子配体/骨保护素平衡

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是由于妇女绝经后，卵巢功能逐步减退引起雌激素分泌减少，导致骨量减少、骨组织微结构退化、骨形成障碍的一类全身性骨骼性疾病，属于中医的“骨痿”。主要病机为肝肾亏虚，骨痿筋弛。左归丸出自《景岳全书》，由熟地、山药、枸杞子、山萸肉、川牛膝、菟丝子、龟板胶、鹿角胶等组成，具有滋阴补肾，益精填髓之功效。已有研究证实，左归丸具有类雌激素样的调节作用，能够防治PMOP。本实验采用摘除卵巢法建立骨质疏松模型大鼠，给予左归丸干预，旨在研究左归丸对骨质疏松大鼠骨密度、骨生物力学及钙(calcium，Ca)、磷(phosphorus，P)、骨保护素(osteoprotegerin，OPG)、细胞核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)、细胞核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor κB，RANK)含量的影响，并进一步探讨与钙、磷代谢和RANKL/OPG比值的关系。

材料与方法 

材料

实验动物：SPF级SD雌性大鼠60只，体质量(180±20)g，购自甘肃中医药大学科研实验动物饲养中心。实验动物质量合格证号：SCXK(甘)2011-0001。

主要试剂：水合氯醛(天津市光复精细化工研究所，批号：20150105)；钙(calcium，Ca)试剂盒(批号20151127)和磷(phosphate，P)测试盒(批号20151204)购自南京建成生物工程研究所；Rat OPG ELISA Kit检测试剂盒(E20151102B)和Rat RANK/RANKL ELISA Kit检测试剂盒(E20151102B)购自上海源叶生物科技有限公司；戊酸雌二醇片(国药准字J20130009)购自拜耳医药保健有限公司；青霉素(国药准字H13020657)购自北京制药股份有限公司。

主要仪器：iMark型自动酶标分析仪(美国Bio-Rad公司)；T6新悦-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；FA2004N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；ZY12306型微量加样器(ScienTiFic产品)；TDZ5-WS型医用离心机(湖南平凡科技有限公司)；双能X骨密度仪(美国GE公司)；AG-IX生物力学万能实验机(日本岛津公司)。

方法

实验药物及给药剂量：左归丸由熟地24 g，山药12 g，枸杞子12 g，山萸肉12 g，川牛膝9 g，菟丝子12 g，龟板胶12 g，鹿角胶12 g等组成。换算成大鼠用量为：105×0.018×5=9.45 g/kg，常规水煎，制成浓度为0.945 g/mL的药液。

动物分组、造模及给药：将60只SPF级SD雌性大鼠采用数字表法随机分为假手术组，切除卵巢组，西药对照组，左归丸高、中、低剂量组，每组10只。参照文献，各组大鼠均用4%水合氯醛(3 mg/kg)腹腔注射麻醉，俯卧位，备皮，消毒手术区皮肤。沿背部后正中线作一1.0~1.5 cm的纵形切口乳白色发亮的脂肪团中找到棕黄色的卵巢，除了假手术组外，结扎其余各组子宫角、摘除卵巢，将伤口逐层缝合。假手术组大鼠仅切除卵巢附近脂肪组织。术后各组动物常规使用青霉素并注意术后保温。计算子宫指数判断造模成功与否，造模成功12周后给予药物干预：西药对照组给予雌激素戊酸雌二醇片(0.09 mg/kg)灌胃治疗；左归丸高、中、低剂量组按19、9.5、4.75 g/kg灌胃治疗，假手术组和切除卵巢组大鼠给予等体积蒸馏水灌胃，每日1次，连续4周。

骨密度测定：末次给药结束后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉各组动物后平置于双能X线吸收测量仪平台上测定右股骨部位骨密度(bone mineral density，BMD)。

动物一般状况观察、体质量及子宫指数：观察并记录各组大鼠体质量、精神状态、毛发、活动、饮食、饮水、大小便等。并摘取各组大鼠的子宫，用精密天平称量各组大鼠体质量计子宫质量，计算子宫指数。子宫指数(mg/g)=子宫质量(mg)/大鼠体质量(g)。

Ca、P测定：末次给药后，腹主动脉采血，静置2~3 h，1 500 r/min，离心10 min，分离血清。检测各组动物血清Ca、P含量等指标。具体操作按试剂盒说明书进行。

OPG、RANK和RANKL水平测定：末次给药后，腹主动脉采血，静置2~3 h，1 500 r/min，离心10 min，分离血清。检测各组动物血清RANKL、RANK、OPG含量等指标。根据标准品，分别制作RANKL、RANK、OPG的标准曲线，求得相关度R2，RANKL R2=0.997，RANK R2=0.995，OPG R2=0.997。计算待测样品的RANKL、RANK、OPG含量。具体操作按试剂盒说明书进行。

骨生物力学检测：处死大鼠后取出完整股骨，将其右侧股骨送至兰州军区总医院，用AG-IX生物力学万能实验机检测最大载荷和弹性模量等相应指标。

统计学方法

采用SPSS 21.0分析软件，统计数据采用均数±标准差(x±s)表示，采用One-Way-Anova法进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

左归丸对切除卵巢骨质疏松大鼠骨密度的影响  与假手术组相比，切除卵巢组大鼠BMD水平显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；与切除卵巢组相比，左归丸各剂量干预组和西药对照组BMD显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)(表 1)。

左归丸对切除卵巢骨质疏松大鼠一般状态、体质量及子宫指数的影响  各组间大鼠一般状态对比发现，与假手术组相比，切除卵巢组、左归丸各剂量组和西药对照组大鼠皮毛粗糙，但各组之间大鼠的精神状态、活动、饮食饮水、大小便均未见异常。与假手术组相比，切除卵巢组、左归丸各剂量组和西药对照组大鼠体质量均显著升高，切除卵卵巢组、左归丸低剂量组子宫指数显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；与切除卵巢组相比，左归丸中、高剂量组和西药对照组大鼠子宫指数均显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；左归丸中、高剂量组和西药对照组体质量降低，而左归丸低剂量组体质量升高，但差异无统计学意义(P＞0.05)(表 2)。

左归丸对切除卵巢骨质疏松大鼠Ga、P的影响与假手术组相比，切除卵巢组大鼠Ca、P水平均显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；与切除卵巢组相比，左归丸中、高剂量组和西药对照组Ca、P水平也显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)(表 3)。

左归丸对切除卵巢骨质疏松大鼠OPG、RANK和RNKL含量的影响与假手术组相比，切除卵巢组大鼠血清OPG水平显著降低，RANKL和RANK水平均显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与切除卵巢组相比，左归丸中、高剂量组和西药对照组大鼠血清OPG含量显著升高，左归丸各干预组和西药对照组大鼠血清RANKL和RANK含量均显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)(表 4)。

左归丸对切除卵巢骨质疏松大鼠骨生物力学参数的影响与假手术组相比，切除卵巢组大鼠股骨的最大载荷、弹性模量等均明显下降(P＜0.05)；左归丸中、高剂量组和西药对照组可明显升高去卵巢大鼠最大载荷参数，左归丸各干预组和西药对照组可明显升高去卵巢大鼠弹性模量参数(P＜0.05)(表 5)。

讨论

绝经后骨质疏松是继高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)及糖尿病后影响中老年女性生活质量的第四大顽症。闭经后的女性随雌激素水平降低会造成骨形成和骨吸收失衡、血清中矿物质含量改变，最终引起骨微结构发生改变和骨脆性增加。目前治疗闭经后骨质疏松症仍然采用雌激素等药物，但雌激素的长时间使用可以引发肿瘤和子宫出血等风险增加。而中药以安全、低毒的优势逐渐成为关注的焦点。左归丸出自《景岳全书》，由熟地、山药、枸杞子、山萸肉、川牛膝、菟丝子、龟板胶、鹿角胶等组成。左归丸方中重用熟地补肾填精，大补真阴，为君药。山萸肉养肝滋肾，涩精敛汗；山药补脾益阴，滋肾固精；枸杞补肾生精益气；龟、鹿二胶均补精髓，龟板胶补阴，鹿角胶补阳，取“阳中求阴”之义，均为臣药；菟丝子、川牛膝益肝肾，强腰膝，健筋骨，俱为佐药。诸药合用，共奏滋阴补肾，填精益髓之效。依据中医的“肾主骨生髓”理论和中医的“肾阴、肾阳双虚型，脾胃虚弱型，气滞血瘀型”等病因病机理论，该方能够有效地防治骨质疏松症。

有研究认为，骨代谢失衡是骨质疏松症发病的重要原因。骨组织骨量及内在的生物力学性能等指标是判定骨质疏松骨性能的重要指标。骨生物力学主要是研究骨组织在外界作用下的力学性能和骨在受力后所产生的生物学效应，是评价药物对骨质量的指标，骨量的减少以及骨质内部结构的改变均能影响骨生物力学，可降低生物力学强度。而BMD的测定是目前公认的诊断骨质疏松和疗效评估的金标准。同时，在骨质疏松症的发展进程中，反映骨吸收与骨形成平衡状况的骨代谢生化指标也随之发生变化。骨无机质中的钙、磷等矿盐是构成骨硬度的主要成分，检测血清中Ca、P含量可间接反映骨矿物质变化情况。已有相关研究证实，中药对调节骨代谢和骨量具有良好效果。本研究结果也显示，左归丸能够提高切除卵巢骨质疏松大鼠的Ca、P含量、BMD、最大载荷和弹性模量。说明左归丸可调节Ca、P代谢、改善骨密度和骨生物力学性能。

现代药理学研究表明，OPG/RANK/RANKL调节轴在骨质疏松发生中有重要意义。RANKL是促进破骨细胞前体细胞分化，诱导破骨细胞生成的关键因子；RANK与RANK形成的复合物参与破骨细胞的分化，促进骨质的吸收；OPG作为肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族成员，与其配体OPGL结合后，可阻止RANKL与OPGL的结合，使RANKL活化受阻，从而抑制破骨细胞生成和成熟破骨细胞的活性。本研究发现，左归丸能够显著提高模型大鼠血清OPG含量，降低RANKL和RANK含量，说明左归丸对OPG/RANK/ RANKL轴有一定调节作用。

综上所述，左归丸可能通过调控OPG/RANK/RANKL调节轴提高骨密度和改善骨生物力学参数，达到防治骨质疏松的目的，也可能是通过调节钙磷代谢影响骨矿代谢，其具体机制尚需要进一步深入研究。