作者：彭方美¹ 刘洋¹ 林晓文¹ 翟玉莹¹ 柯诗韵¹ 肖珊¹ 叶小天¹ 陈珺¹ 李青南² 李文德² 陆幸妍¹

单位：

1. 广东药科大学生命科学与生物制药学院广东省生物技术候选药物研究重点实验室

2. 广东省实验动物监测所广东省实验动物重点实验室

摘要：目的 比较近交系和封闭群wistar大鼠在地塞米松（dexamethasone，Dex）不同给药频率作用下骨量、骨结构和骨力学性能变化，为不同遗传背景大鼠的糖皮质激素性骨质疏松（glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP）模型制备提供实验依据。方法 3月龄SPF级两种品系雌性Wistar大鼠各32只采用数字法随机分为4组：近交系的对照组（J-C）和Dex低、中、高频给药组（J-L、J-M和J-H）；封闭群的对照组（F-C）和Dex低、中、高频给药组（F-L、F-M和F-H），C组肌注0.9%氯化钠注射液（1 mL/kg，3次/周）；L、M和H组分别肌注Dex（1 mg/kg，分别1、3、5次/周），共给药3个月，处死前进行2次荧光标记。取大鼠胫骨上段（proximal tibia，PTM）进行骨组织形态计量学分析，取股骨和第五腰椎行分别行三点弯曲和压缩试验测定。结果 （1）与J-C组比较，J-M和J-H组生长板下骨小梁结构紊乱，各给药组静态参数差异均无统计学意义（P > 0.05）；J-H组骨矿化沉积率（mineral apposition rate，MAR）、荧光周长百分率（percent fluorescence perimeter，% L.Pm）、骨形成率-组织（bone formation rate/tissue，BFR/TV）、骨形成率-体积（bone formation rate/volume，BFR/BV）和骨形成率-周长（bone formation rate/bone surface，BFR/BS）分别下降39.27%、61.92%、79.21%、75.08%和77.14%；单位骨小梁周长成骨细胞数（osteoblast number/unit trabecular perimeter，Ob.N/BS）、成骨细胞周长百分率（percent osteoblast perimeter，% Ob.S/BS）分别下降57.35%和61.16%；单位骨小梁周长破骨细胞数（osteoclast number/unit trabecular perimeter，Oc.N/BS）、破骨细胞周长百分率（percent osteoclast perimeter，% Oc.S/BS）分别下降50.29%、42.92%；最大载荷、最大应力、弹性载荷、股骨长度、最大断裂吸收能、骨材料韧性均显著下降（P < 0.05）。（2）与F-C组比较，F-M组和F-H组均呈骨量减少、骨结构破坏表现，F-H组MAR、% L.Pm、BFR/TV、BFR/BV、BFR/BS差异均有统计学意义（P < 0.05）；Ob.N/BS和% Ob.S/BS分别下降87.36%、87.9%，Oc.N/BS、% Oc.S/BS分别增加186%、123%；三点弯曲及压缩参数均显著下降。结论 以3、5次/周肌注Dex 1 mg/kg给药3个月，可以成功诱导封闭群Wistar大鼠GIOP成模，但未能使近交系wistar大鼠呈现低骨量效应，显示不同遗传背景个体及不同部位骨组织对糖皮质激素骨损伤效应有易感性差异。相对于骨量指标，反映骨结构、骨强度和骨形成功能的指标对糖皮质激素骨损伤效应较为敏感。

关键词：Wistar大鼠；地塞米松；糖皮质激素性骨质疏松；骨形态计量学；骨生物力学

随着糖皮质激素(glucocorticoid，GC)在临床上应用越来越广泛，糖皮质激素性骨质疏松(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)已成为最常见的继发性骨质疏松，易引发骨折且往往预后不良，严重影响患者的生活质量。GIOP确切病理机制不明，合适的GIOP动物模型是开展相关研究的基础。目前，GIOP模型动物有灵长类的猴、猩猩和哺乳类的兔子、绵羊、山羊、狗、猪以及啮齿类的大鼠、小鼠等，以SD和Wistar大鼠最为常用，且仅见于封闭群大鼠GIOP造模报道。封闭群动物基因组成具有高度杂合性和个体间反应的差异性，其遗传异质性类似于人类群体遗传，适用于群体遗传研究、药物筛选、毒物试验、生物制品和化学制品鉴定等。GC临床用药难以界定“安全剂量”，GIOP的发生往往与个体易感性相关，易感病患在GC常规剂量和疗程下也易出现GIOP。显然，封闭群大鼠并非是GIOP遗传易感性机制研究的首选。近交系动物具有群内基因组成相同，表型一致、遗传稳定等优势，是研究遗传机制的最佳选择。本研究探究建立近交系大鼠GIOP模型的优化方案，并通过比较近交系和封闭群Wistar大鼠GIOP成模差异，筛选更稳定优质的GIOP动物模型，为GC骨损伤效应的易感性差异提供实验依据。

实验动物及分组

3月龄SPF级近交系(J)和封闭群(F)雌性Wistar大鼠各32只，体质量(200±3) g。近交系Wistar大鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(质量合格证号：200700566001)。封闭群Wistar大鼠由中山大学(大学城)实验动物中心提供(质量合格证号：44008500006272)。两种品系大鼠分别采用数字表法随机分为4组：近交系对照组(J-C)和Dex低、中、高频给药组(J-L、J-M和J-H)；封闭群对照组(F-C)和Dex低、中、高频给药组(F-L、F-M和F-H)，每组8只，大鼠适应性喂养1周后，C组肌注0.9%氯化钠注射液(每次1 mL/kg) 3次/周，L、M、H组肌注地塞米松磷酸钠注射(每次1 mg/kg) 1、3、5次/周，共计给药3个月。各组大鼠饲养条件相同，每周称量并记录体质量1次，按体质量调整给药剂量。

药物与仪器

地塞米松磷酸钠注射液(辰欣药业股份有限公司，规格1 mL:2 mg，批号为1405216421)；Sigma钙黄绿素，批号为SLBK2975V；Leica RM2255切片机；BQ OSTEO骨形态计量学系统；Lloyd生物力学机。

动物荧光标记及取材

所有大鼠在药物干预结束前14、13及4、3 d，在颈部皮下注射钙黄绿素(5 mg/kg)进行两次荧光标记，以动态观察两次注射期间骨形成情况。实验结束前12 h禁食，次日，按动物实验规范，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后心脏采血处死，取右侧胫骨上段(proximal tibia metaphyses，PTM)做不脱钙硬组织包埋，每个标本分别切5 μm(薄片)和9 μm (厚片)，薄片用甲苯胺蓝染色，厚片直接封片，切片进行骨形态计量学参数检测，按公式计算出相应参数；取右侧股骨和第5腰椎，剔除附着之肌肉、筋膜(保留骨膜)，以生理盐水浸润的医用纱布包裹，锡纸包于其外，-20 ℃冰箱冻存，待行骨生物力学分析。

骨组织形态计量学参数

骨形态计量学参数包括静态参数、动态参数和细胞参数。静态参数：骨小梁面积百分数(trabecular area，%Tb.Ar)、骨小梁宽度(trabe-cular width，Tb.Th)、骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)和骨小梁分离度(trabecular separation，Tb.Sp)反映骨量和骨结构。动态参数：荧光周长百分率(%L.Pm)、矿化沉积率(MAR)、骨形成率(BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV)，反映骨重建中骨基质形成和骨矿化动态过程。细胞参数：成骨细胞数量(Ob.N/BS)、破骨细胞数量(Oc.N/BS)、成骨细胞周长百分率(%Ob.S/BS)、破骨细胞周长百分率(%Oc.S/BS)，反映骨功能性细胞(成骨细胞和破骨细胞)的变化特性、活跃程度。

骨生物力学测定

三点弯曲试验是对密质骨的力学性能测定，其参数包括：最大载荷、最大应力、弹性载荷、股骨长度；压缩试验常用于松质骨力学特性测试，其参数包括：最大载荷、最大断裂吸收能、最大应力、骨材料韧性。参数测量方法、数据表达及计算参照文献。

统计学处理

应用SPSS 20.0统计软件进行分析处理，数据均值±标准差(x±s)形式表示，组间行方差齐性检验、单因素方差分析(oneway ANOVA)，以P＜0.05为差异有统计学意义。

PTM静态参数变化

近交系大鼠中，与J-C组相比，J-M、J-H组初级海绵体骨小梁较密集，排列无序，J-L、J-M、J-H组静态参数变化差异均无统计学意义(P＞0.05)(图 1)。封闭群大鼠中，与F-C组相比，F-L组骨小梁较密集排列规整，%Tb.At、Tb.Th、Tb.N增加、Tb.Sp降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)；F-M、F-H组骨小梁数量减少、变细、排列稀疏，除F-M组Tb.Th外，各参数差异均有统计学意义(P＜0.05)，且组间呈剂量依赖性(表 1)。

PTM动态参数变化

近交系大鼠中，与J-C组相比，J-L、J-M组MAR、%L.Pm、BFR/TV、BFR/BV和BFR/BS有下降趋势，但差异无统计学意义；J-H组各参数差异均有统计学意义(P＜0.01)。与J-L、J-M组相比，J-H组MAR (P＜0.05)、%L.Pm、BFR/TV、BFR/BV和BFR/BS (P＜0.01)显著减小。封闭群大鼠中，与F-C组比较，F-L、F-M组各参数变化差异无统计学意义，F-H组显著下降。与F-L组相比，F-M组MAR (P＜0.05)、BFR/TV、BFR/BV和BFR/BS显著减小(P＜0.01)，F-H组各参数均显著下降(P＜0.01)，与F-M组相比，F-H组MAR (P＜0.05)、L.Pm、BFR/BS显著下降(P＜0.01)，组间呈剂量依赖性(表 2)。

PTM成骨细胞和破骨细胞参数变化

两种品系M、H组骨组织切片内脂肪细胞显著增多，成骨细胞参数：与C、L、M组相比，近交系H组Ob.N/BS、%Ob.S/BS显著减少；与C、L组相比，封闭群M、H组Ob.N/BS、%Ob.S/BS显著减少(P＜0.01)(表 3)。破骨细胞参数：与C组相比，近交系L、M、H组%Oc.S/BS显著减少(P＜0.05)，M组Oc.N/BS显著减少(P＜0.05)；封闭群：与C、L组相比，M、H组Oc.N/BS、%Oc.S/BS显著减少(P＜0.01)(图 3)。

股骨三点弯曲试验检测

在近交大鼠中，与J-C组相比，J-L、J-M组最大载荷及弹性载荷显著下降(P＜0.05)(表 4)；J-H组参数均显著下降；在封闭群大鼠中，与F-C组相比，F-L组参数差异无统计学意义(P＞0.05)；除F-M最大应力差异无统计学意义(P＞0.05)，F-M和F-H组参数均显著下降。

腰椎压缩试验检测

近交系大鼠中，与J-C组比，J-H组最大断裂吸收能、骨材料韧性显著下降(P＜0.05)，其余各组差异无统计学意义(P＞0.05)；封闭群大鼠中，与J-C组相比，F-L、F-M、F-H组各项指标均显著下降，与F-L、F-M组对比，F-H组最大载荷显著下降(P＜0.05)(表 5)。

GIOP的动物模型可选择鼠、兔、羊等动物，目前大鼠是使用最多的模型动物，常用的有SD和Wistar大鼠。常用激素有泼尼松、泼尼松龙或Dex等，且剂量多样化，其中Dex有效建模量有：0.12 mg/kg、1 mg/kg、7 mg/kg等，常用的方法有灌胃、肌肉注射、皮下埋植和腹腔注射等，每天给药或每周2~6次给药4~12周可出现明显的骨丢失。本研究在参考临床用药及前期实验研究基础上，采用3月龄近交系、封闭群Wistar大鼠，以每Dex 1.0 mg/ kg，每周1、3、5次不同频率肌肉注射，共给药3个月，通过不同品系大鼠对糖皮质激素诱导骨质疏松模型的评价，进一步指导实验动物品系的选择。

骨形态计量学指标是骨组织微结构的重要评价指标，反映机体组织形态学的变化。各组大鼠给药3个月后，用骨组织形态计量学的方法测量，与F-C组比较，F-L组有增加松质骨骨量，改善骨结构，促进成骨细胞活性，抑制破骨细胞活性的趋势，但变化差异无统计学意义(P＞0.05)。说明低频率GC在一定程度上可促进骨形成，增加松质骨骨量。这与一些体外实验结果一致，在一定剂量范围内，Dex具有一定的促成骨分化作用。F-M、F-H组均表现松质骨骨量丢失，抑制骨形成、成骨细胞的活性、促进破骨细胞活性，但F-M组各参数变化差异无统计学意义(P＞0.05)，F-H组参数变化差异均有统计学意义(P＜0.05)。与F-L组比，F-M、F-H组骨形态计量学参数变化差异均有统计学意义(P＜0.05)。与F-M组比，F-H组动态参数变化差异有统计学意义(P＜0.05)，静态、细胞参数有下降趋势但差异无统计学意义(P＞0.05)。组间存在剂量效应关系，且F-H组较F-M组显著抑制骨形成、破坏骨结构。提示F-M、F-H组大鼠呈典型骨质疏松状态。

近交系大鼠J-M、J-H组局部骨小梁密集、排列无序，与J-C组比较，J-L、J-M、J-H组松质骨静态参数呈不同程度下降趋势，但变化差异无统计学意义(P＞0.05)，而J-H组骨形成指标MAR、L.Pm、BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV、成骨细胞数量、活性显著下降，差异有统计学意义(P＞0.05)，但破骨细胞数量无显著变化。J-L组与F-L组表现不同，J-L组未增加松质骨骨量，J-H组较J-L、J-M组抑制骨形成、成骨细胞活性的表现较明显。提示近交系大鼠Dex低中高频给药3个月后未出现骨量丢失。其原因可能与近交系大鼠对Dex的敏感性有关。上述结果提示：在Dex相同给药频率作用下，不同遗传背景大鼠在骨形态学上对DEX骨损伤效应的易感性表现不一致。

骨的生物力学性能包括骨的结构力学和骨的材料力学两个方面，本实验采用三点弯曲、压缩试验分别对大鼠股骨、第五腰椎的生物力学进行测试，结果显示两品系的股骨三点弯曲试验表现相对一致：与C组相比，两品系M、H组最大载荷、最大应力、弹性载荷、股骨长度均显著下降，差异有统计学意义，J-L组最大载荷、弹性载荷显著下降，而F-L组最大载荷、弹性载荷无显著性变化，表明近交系大鼠的股骨较封闭群对Dex损伤作用更为敏感。但另一方面，封闭群3个频率组腰椎压缩试验参数均显著下降，差异有统计学意义，而近交系大鼠中仅H组最大断裂吸收能、骨材料韧性下降，又显示封闭群大鼠的腰椎较近交系对Dex损伤作用更敏感。由此体现两种品系大鼠的股骨、腰椎在生物力学上对Dex损伤效应同样表现易感性不一致。

骨重建是破骨细胞和成骨细胞共同完成的旧骨退化，等量新骨取代的骨组织更新过程，在骨重建过程中，许多激素和细胞、体液因子以及细胞代谢产物影响骨的重建。通过促进或抑制成骨细胞和破骨细胞的发育，提高或抑制成骨细胞和破骨细胞的活性，对骨重建起加速或延迟作用。GIOP发生是GC影响下多基因代谢变化的共同作用。本研究结果显示，Dex中高频给药3个月后，封闭群大鼠更适合GIOP模型的建立，两品系大鼠在骨形态计量学及生物力学的不同反应性正是反映了在不同遗传背景大鼠及不同部位骨组织中GC的易感性存在差异性。