作者：程健豪 傅文贞 何进卫 汪纯 章振林

单位：上海交通大学附属第六人民医院骨质疏松与骨病专科

摘要：目的 Kozlowski型脊柱干骺端发育不良（Kozlowski type spondylometaphyseal dysplasia，SMDK）是一种罕见的常染色显性遗传病。本文报道了1例SMDK患者家系的临床特征，并进行致病基因突变检测，同时复习相关文献。方法 1例SMDK先证者及其患病母亲及5例健康家庭成员，外周血抽提基因组DNA进行瞬时感受器电位离子通道亚家族蛋白4编码基因（transient receptor potentialcation channel subfamily V member 4，TRPV4）16个外显子Sanger测序，并以100名健康志愿者作为基因突变分析的对照。同时对先证者和其母亲进行体格，生化及放射学检查。结果 先证者及其母亲临床表现为髋内翻畸形，膝外翻畸形，脊柱侧弯且伴有干骺端的改变。Sanger测序显示TRPV4基因（c.1781G > A）杂合突变，其他家族成员及健康对照者均未发现相同突变。结论 本研究发现的TRPV4基因11号外显子错义突变（c.1781G > A）为该家系致病突变。

关键词：Kozlowski型脊柱干骺端发育不良；TRPV4基因；突变

Kozlowski型脊柱干骺端发育不良(Kozlowski type Spondylmetaphyseal dysplasia，SMDK)是一种以脊柱侧弯、扁平状椎体和干骺端发育异常为特征的罕见遗传性骨病，其遗传方式为常染色体显性遗传。SMDK童年时期起病，婴儿期多表现正常，及早发现和治疗对于改善预后及开展遗传干预有重要意义。

本文通过对1例Kozlowski型脊柱干骺端发育不良家系进行致病基因鉴定和临床表现分析，同时对相关文献进行复习，探讨SMDK患者典型的临床表现、基因型和表型的关系及其发病机制，旨在提高临床医生对此类罕见遗传性骨代谢病的认识。

对象

本研究对象经上海交通大学附属第六人民医院伦理委员会批准，参与研究的全部家系成员均签署知情同意书。

先证者为24岁的女性(图 1，Ⅲ-1)，父母非近亲婚配，其为第一胎，足月剖腹产，出生时身高体质量与同龄儿相当。7岁时出现脊柱侧弯。患者因双膝关节畸形伴有脊柱侧弯10余年来上海交通大学附属第六人民医院就诊。查体：身高135 cm，体质量55 kg，脊柱明显侧弯。髋关节内翻畸形，膝关节外翻畸形，呈X型腿并伴有手指粗短(图 2)。听力、视力和智力正常。患者母亲52岁(图 1，Ⅱ-2)，身高140 cm，体质量50 kg。患者母亲自幼身高较同龄人矮小。因先证者正处于妊娠期，故未对其进行X线检测，仅对其母亲进行了双手、骨盆、双侧股骨、胸腰椎正侧位X线检查。

方法

外周血基因组DNA提取：患者签署知情同意书后，采集患者和100名正常人外周血2 mL，用EDTA二钠抗凝。采用全血DNA提取试剂盒(上海莱枫生物科技公司试剂盒)提取血样本DNA。用分光光度仪检测DNA浓度。

PCR扩增及突变检测：从在线数据库(GenBank accession NC_000012)中获得瞬时感受器电位离子通道亚家族蛋白4编码基因(transient rece-ptor potentialcation channel subfamily V member4，TRPV4)的DNA序列。利用之前报道的引物PCR扩增TRPV4基因的16个外显子(包括外显子内含子交界区)。所有引物均由上海Invitrogene公司合成(表 1)。采用PCR反应试剂盒(美国Promega公司)进行外显子扩增。反应体系为2×Go Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，超纯水10.5 μL，DNA样本1 μL。PCR反应条件为：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火57~64.5 ℃(根据不同引物调整)，72 ℃延伸1 min，34个循环，最后终端延伸72 ℃10 min。PCR反应产物经电泳鉴定特异性后，送上海天昊公司进行Sanger测序分析。

X线检测

先证者母亲双手掌骨近端变尖，指骨干骺端增宽，指掌骨明显变粗短，两侧尺桡骨未见明显异常(图 3A)；双侧股骨干骺端增宽，结构紊乱，密度增高，其内内有不规则条索状及团块状高密度影，且右侧胫骨平台中央成刺状突出，关节间隙未见缩窄(图 3B)；胸椎诸椎体变扁同时间隙增宽，椎弓根变长。侧位片呈现椎体变扁，椎体前缘呈楔形改变(图 3C)；髋臼畸形顶扁平、双侧髂骨周边呈现不规则形态，双侧近端股骨呈现矛状(图 3D)。

骨代谢生物化学检查

先证者与其母亲的N端骨钙素，Ⅰ型胶原交联羧基末端肽降解产物(β-cross linked C-telope-ptide of type Ⅰ collagen，β-CTX)均升高，25羟维生素D(25 hydroxyvitamin D, 25OHD)水平低，血钙及血磷正常(表 2)。

测序结果

先证者及其母亲的TRPV4基因存在相同的杂合突变位点，先证者11号外显子发生错义突变(c.1781G＞A)(图4)，所编码蛋白质第594位氨基酸由精氨酸变为组氨酸(p.Arg594His)。在其家系的其余成员及100名健康对照人群中均未发现有此突变。

目前认为SMDK是由包括COL2A1基因和TRPV4基因在内的多种基因突变导致的。同时亦有1例GPX4基因突变导致SMDK的报道。Ⅱ型胶原纤维α1基因(collagen 2A1，COL2A1)，COL2A1基因编码产物为Ⅱ型胶原蛋白。COL2A1基因突变会导致Ⅱ型胶原纤维结构发生改变，或引起维系胶原蛋白的三级结构稳定性的一些因素(如偶极子-偶极子相互作用和范德华力相互作用)改变从而致使胶原分子降解加快，而这些异常均会引发疾病。一般将此基因突变导致的一系列疾病统称为Ⅱ型胶原病，临床常见病种主要有两大类：骨骼-软骨发育不良和骨关节炎疾病。前者包括Kniest发育不良、Ⅱ型软骨成长不全(achondrogenesis type 2，ACG2)、软骨形成不足(hypochondrogenesis，HCG)、脊柱干骺端发育不良(spondylometaphyseal dysplasia，SMD)以及临床表型较轻的先天性脊柱骨骺发育不良(spondyloepiphyseal dysplasia congenita，SEDC)和脊柱周围发育不良等。骨关节疾病则相对较少，包括骨关节炎和双侧缺血性股骨头坏死等。2013年Matsubayashi等报道了1例由COL2A1基因杂合突变所引起的SMD病例。而国内尚无COL2A1基因突变导致SMD的报道，而仅在2007年和2013年发现两例此基因突变导致的SEDC的病例报道，1例为COL2A1基因的23号外显子(C.1510 G＞A)错义突变，1例为COL2A1基因42号外显子(c.2735G＞A)错义突变。因此，若在临床上遇见类似病例，应考虑COL2A1基因突变的可能性。

TRPV4是香草素受体渗透压感受通道(vanilloid receptor related osmotically activated channel)成员。是一种非选择性阳离子通道，对钙离子具有适中的通透性。TRPV4基因有6个跨膜区(T1~T6)和位于T5和T6之前的襻环结构，通道的氨基酸存在3~4个锚连蛋白重复区(ankyrin repeat domain, ANK)。可被生物体内外环境中机械力、热和低渗透压等各种理化刺激所激活，参与机体内环境稳态的维持，同时也对生长发育起重要作用。在骨骼发育领域，TRVP4基因目前已被证实与包括短躯干症3型(barchyolmia type 3)、SMDK、类扭伤型侏儒(parastremmatic dwarfism)、脊柱骨骺发育不良(spondylepiphseal dysplasia maroteaux type，SED)和变形性骨发育不良(metatropicdysplasia，MD)等多种骨骼疾病相关。2009年研究报道了6例TRPV4基因突变所致的SMDK，共报道了3个新发突变位点，其中4例为11号外显子错义突变(c.1781G＞A，p.R594H)、1例为6号外显子错义突变(c.A992＞G，p.D333G)、1例为13号外显子错义突变(c.2146G＞T，p.A716S)。本研究先证者同样是11号外显子(c.1781G＞A，p.R594H)突变携带者，由此为确诊SMDK提供了依据。同时该研究在4例相同突变位点(c.1718G＞A)的患者中，脊柱侧弯程度、关节的挛缩程度和骨盆形态等临床表型却迥然不同，其中某些患者的表型与MD颇为相似。由此可见，SMDK是一种有遗传异质性的疾病。本文先证者所携带的(c.1781G＞A，p.R594H)突变位点位于TRPV4基因的跨膜区，594号精氨酸被证实在TRPV家族内高度保守并且被证实对化学信号刺激(钙离子浓度)的检测和传导非常重要。而运用携带突变位点质粒的重组细胞进行的体外电生理实验显示，无论是否给予此离子通道激动剂，细胞内钙离子内流均高度增加。由此推测，SMDK可能与持续性软骨细胞钙离子内流相关。同时其他研究也显示TRPV4基因在成骨细胞及破骨细胞同时表达，而刺激TRPV4基因可以促进软骨生成，这或许是骨骼发育不良的另一个成因。除了此报道之外，2010年Dal等报道了SMDK患者第15号外显子(c.2389G＞A，p.E797K)发生杂合突变，国内亦有1例15号外显子(c.2389G＞A，p.E797K)突变所致的SMDK的报道。

SMDK的诊断应结合患者的临床症状、X线表现及致病基因突变检测。在临床上，患者可表现为生长发育迟缓、躯干短小、脊柱进行性弯曲畸形，但血液生化指标一般无明显异常，放射学检查可表现为脊柱侧位片上呈现胸椎诸椎体变扁，同时伴有上下椎体间隙增宽。而在脊柱正位片上呈现楔形椎弓根变长。骨盆平片可表现为髋臼顶较为扁平，而双侧近端股骨呈现凹凸不平的矛状。根据Nemec等研究，幼年患者除上文描述的扁平状髋臼顶外，骨盆正位X线有如下特点：髋臼和股骨骨骺间距较同龄儿增宽，同时伴有腕骨骨化延迟。而随着年龄的增加，患者股骨近端干骺端和骨骺的生长板面出现硬化，骨骺生长板较同龄人加宽。

结合文献复习分析本病例有以下特点：(1)患者躯干短小、脊柱侧弯、X线提示扁平状椎体等典型临床特征；(2)鉴定明确先证者TRPV4基因携带突变位点是已经在研究报道中发现的热点突变，并且体外研究已证实此热点突变导致功能改变；(3)在正常人群中并未找到该突变。本例患者正是基于上述临床及致病突变鉴定而确诊为SMDK。

综上所述，本例患者为TRPV4基因错义突变(c.1781G＞A，p.Arg594His)导致的SMDK，结合先证者和家系成员临床表现及基因测序结果，通过文献复习，总结了此疾病的临床表现和突变位点，证实突变的基因和临床表型在SMDK病中具有一定的相关性，有助于此类疾病的深入研究。