作者：孙般若¹ 李春霖¹ 张令强²

单位：

1.中国人民解放军总医院老年内分泌代谢病科 国家老年疾病临床医学研究中心

2.北京蛋白质组研究中心蛋白质组学国家重点实验室 国家蛋白质科学中心

摘要：泛素-蛋白酶体系统是维持细胞内蛋白质稳态和功能的重要调节途径，泛素化参与调节细胞的增生、分化和存活，泛素化调节异常可导致代谢性骨病、肿瘤等疾病的发生。越来越多的证据表明泛素-蛋白酶体系统参与调控成骨细胞功能和骨形成。泛素连接酶（E3 ubiquitin ligases，E3）作为泛素和底物蛋白之间的衔接分子可特异性识别底物，在骨形成相关蛋白调节和骨转换过程中具有重要的意义。既往研究表明E3连接酶通过介导酪氨酸激酶受体、信号蛋白和转录因子等参与成骨细胞增生、分化、存活和骨形成的调节。Smurf1、Cbl和SCFβ-TrCP等E3连接酶可特异性介导Runx2、MEKK2、JunB、β-catenin、Gli2、ATF4等成骨细胞分化重要调节蛋白的降解，抑制成骨功能。E3连接酶作为促进骨形成和减少骨丢失理想的治疗靶标，具有广阔的研究前景。本文对E3连接酶在骨形成调节中的作用及机制进行回顾和总结。

关键词：泛素连接酶；骨形成；成骨细胞；治疗靶标

泛素化是体内蛋白质翻译修饰的一种常见形式，是内源性蛋白降解主要方式之一，在调控细胞存活、增生、分化和凋亡中发挥重要作用，其功能失调与肿瘤、心血管疾病、骨代谢疾病的发病密切相关。泛素化过程是指泛素分子在泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme, E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzymes, E2)和泛素连接酶(E3 ubiquitin ligases, E3)等一系列酶的作用下，与细胞内的靶蛋白分子结合并对靶蛋白进行特异性修饰的过程。在泛素化过程中，E3连接酶作为支架蛋白与E2相互作用最终将泛素分子转移到底物蛋白上，可特异性识别底物蛋白，在泛素化过程中具有非常重要的作用。不同的E3连接酶作用于不同的底物蛋白，决定了泛素化的特异性。

近年来，随着对成骨细胞分化和功能起关键调控作用的信号转导通路和转录因子的研究深入，发现E3连接酶在维持成骨细胞正常的生理功能中发挥重要的调节作用。Smad蛋白(signaling mothers against decapentaplegic，Smad)和Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)是成骨细胞增生和分化过程中的关键调控因子，在mRNA和蛋白水平的表达受严格调控，相互作用共同促进成骨细胞基因的表达和分化。近年来的研究发现，Smad1和Runx2均可被E3连接酶Smad泛素化调节因子(Smad ubiquitylation regulatory factor 1，Smurf1)特异性识别和泛素化降解，确立了泛素-蛋白酶体降解系统是调控骨形成蛋白水平的重要机制之一，而且越来越多的证据表明骨质疏松症等代谢性骨病伴随E3连接酶表达异常和功能障碍。E3连接酶作为潜在的骨代谢相关疾病研究的热点和药物开发的新靶标，在骨质疏松症预防和治疗领域的研究具有广阔的前景。

人类基因组有600~1 000余种E3连接酶，根据E3连接酶与底物蛋白相互作用的结构域和作用机制不同分为三大家族。

HECT结构域家族

HECT(homologous to E6-APC terminus)泛素连接酶家族包含E6-AP羧基末端同源结构域，与泛素通过硫酯键形成复合物，催化底物蛋白的泛素化，其命名源自第一个家族成员的发现：E6AP可与肿瘤蛋白E6相互作用后促进P53的泛素化和降解。该家族中研究比较深入的C2-WW-HECT亚家族成员包括Nedd4-1、Nedd4-2、Itch、Wwp1、Wwp2和Smurf1/2。其中Smurf1/2是研究最多的与骨生物学相关的E3连接酶。分子生物学和转基因小鼠模型研究揭示Smurf1有负调节成骨细胞系细胞的功能，包括增生、分化、成熟，而Smurf2主要影响软骨细胞的功能，Smurf2转基因小鼠模型可出现骨关节炎样表型。

含有环指结构域家族

包括单分子结构的Cbl和多分子结构的SCFβ-TrCP等。含有环指结构域(ring finger domain)RING类E3连接酶家族最典型的特点是含有环指结构域，此类E3连接酶活性依赖于环指结构，将活化的泛素由E2转移到靶蛋白上，与HECT类连接酶不同的是其本身并不与泛素发生相互作用，其家族成员Cbl和SCFβ-TrCP与骨代谢调节密切相关。Cbl蛋白属RING类单分子结构E3连接酶，包含酪氨酸激酶结合域(tyrosine kinase binding，TKB)和RING结构域两个进化高度保守的重要结构域，其作为生长因子受体和非酪氨酸激酶受体的负向调节因子，在维持正常成骨细胞功能和骨代谢疾病发病过程中发挥重要作用。除了Cbl外，RING类E3连接酶SCFβ-TrCP能特异性识别并泛素化降解β-catenin、Gli2和ATF4等转录因子或信号转导蛋白，是成骨细胞分化的重要调节因子

U-box结构域家族

其结构和功能特点上与RING结构域相似，其家族成员包括CHIP(C-terminus of Hsc70-interacting protein)等。U-box家族是HECT家族和RING家族后发现的一种新的类型E3连接酶。该家族成员羧基端都包含一个相对保守的、在结构和功能上均与RING类E3连接酶的RING-finger结构域极其相似U-box结构域，该结构域是此类泛素连接酶酶活性所必需的结构。近年来研究发现U-box家族类E3连接酶CHIP可介导Runx2的泛素化降解。

成骨细胞在骨形成中起着核心作用，从骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)到成熟成骨细胞的分化是骨形成的主要生理过程，也是一个涉及多种信号转导和基因表达的转录的精密调控的过程。涉及成骨细胞分化调控的众多因素和信号转导通路构成一个相互关联的复杂网络结构，包括Runx2、活化因子-1(activator protein 1，AP-1)、活化转录因子-4(activating transcrip-tion factor 4，ATF4)等关键转录因子和转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)/骨形态生成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、Wnt/β-catenin、Hedgehog、成纤维生长因子(fibroblast growth factor，FGF)和甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)信号通路等，其中Runx2是成骨细胞分化和骨形成关键的核心转录因子。E3连接酶通过调控上述骨形成关键转录因子和信号转导蛋白活性及水平在骨代谢中发挥重要的作用。目前研究比较深入的E3连接酶包括Smurf1、SCFβ-TrCP及Cbl等（表1）。

表１　泛素连接酶与其骨代谢相关的底物调节蛋白

E3连接酶对转录因子Runx2的调控作用

Runx2是Runt结构域转录因子家族的一员(该家族还包括Runx1和Runx3)，参与多种信号通路转导，在成骨细胞分化的多种信号途径中起核心作用，是成骨细胞谱系定向分化早期和晚期阶段所必需的核心转录因子。发育遗传学研究表明，在生物进化中高度保守的细胞核内转录因子Runx2是成骨细胞分化和骨形成过程中的主基因(master gene)，Runx2缺失将导致骨发育不良或停止。Runx2基因缺失的纯合子小鼠出生后因肋骨发育不良而无法存活，躯干及肢体短小。

Smurf1通过泛素-蛋白酶体依赖的方式作用于骨形成核心转录因子Runx2，介导其降解从而抑制成骨细胞分化和骨形成。相反，抑制Smurf1表达可增加Runx2蛋白水平促进MSCs的成骨向分化，从而促进体内骨形成。合成代谢因子BMP2诱导Runx2乙酰化可拮抗由Smurf1调控的Runx2降解。Smurf1除了直接诱导Runx2降解，还可通过Smad1/5/6/7依赖的间接作用介导Runx2降解。除了Smurf1，其他HECT类E3连接酶成员Wwp1也可介导Runx2的降解。Wwp1可与Runx2和锌指结构接头蛋白schnurri-3相互作用，诱导Runx2多聚泛素化和蛋白酶体降解增加。Schnurri-3基因缺陷小鼠出现成骨细胞的基因表达和细胞活性增加，但破骨细胞分化和活性无改变。Wwp1-/-小鼠同样表现为Runx2基因表达和骨量增加。近年来研究发现U-box家族类E3连接酶CHIP也参与Runx2的泛素化降解, 在MC3T3-E1细胞中过表达CHIP可促进Runx2降解和抑制成骨细胞分化，而敲除CHIP可增强成骨细胞分化。研究还发现内源性CHIP蛋白水平在成骨细胞分化Runx2蛋白水平增加的过程中逐渐下降，但Runx2的mRNA水平并无显著变化。但同样参与Runx2调节的E3连接酶Smurf1和Schnurri-3/Wwp1并没发现类似的水平下降。研究者分析认为CHIP在细胞分化前介导Runx2蛋白维持在较低水平，而Smurf1和Wwp1在细胞分化开始后参与Runx2蛋白水平的稳定。

E3连接酶在TGF-β/BMP信号通路中的作用

TGFβ/BMP信号通路在骨骼发育和出生后的骨形成中发挥重要的生物学作用，参与MSCs、成骨细胞前体细胞及成熟的成骨细胞分化和功能的调控。所有TGF-β超家族成员均通过Ⅰ型和Ⅱ型跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶双受体系统实现信号转导。在TGF-β超家族成员受体激活产生的信号转导至细胞核内的靶基因的过程中，Smad蛋白发挥核心作用。TGF-β超家族中的几个成员如BMPs具有较强的成骨作用。当受体激活后，BMPs通过Smad依赖的和非Smad依赖的途径进行信号转导，其中非Smad依赖途径包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun n-terminal kinase，JNK)和p38 MAP激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路。BMP信号通路激活后，Smad1/5/8可与Runx2直接相互作用，协同调控靶基因的转录促进间充质干细胞的成骨分化。BMP-2也可经蛋白激酶D(PKD)途径激活JNK和p38，促进成骨细胞分化。TGF-β/BMP同时激活Smad和p38 MAPK两种途径并汇聚在Runx2基因调控间充质干细胞的分化。

Smads是TGF-β和BMP信号通路中不可或缺的重要组成部分，而E3连接酶Smurf1与Smad1相互作用参与骨形成的调节的研究表明了泛素介导的蛋白酶体降解在TGF-β/BMP-2信号转导通路具有重要的调节作用。1999年研究人员利用非洲爪蟾蜍Smad1作为诱饵，首次发现E3连接酶Smurf1可与Smad1相互作用，并诱导Smad1的泛素化和蛋白酶体降解。2001年Podos团队对果蝇Smurf(DSmurf)的研究显示突变DSmurf引起与DPP(人类BMP2/4同源基因)信号下调，表明Smurf1参与BMP信号通路的调节。研究表明Smurf1介导BMP受体调节的下游因子Smad1的降解，从而抑制BMP诱导的成骨细胞分化，而通过RNAi抑制Smurf1表达或表达非催化活性的Smurf1，可增强成骨细胞分化。分子生物学研究表明Smurf1通过其WW结构域特异性识别Runx2和Smad1的PY motif，介导Runx2和Smad1多聚泛素化和通过26S蛋白酶体降解，在BMP信号通路中负向调控骨形成。

        Smurf1基因敲除小鼠可正常出生、存活和发育，平均寿命与同窝野生型小鼠相似，然而Smurf1基因敲除小鼠在大约4月龄时可出现成骨细胞活性增强，继而引起骨量增加，证明Smurf1在成熟成骨细胞骨形成活动中发挥重要的生理作用。但是，Smurf1基因敲除小鼠并没有出现BMP信号和Runx2活性的增强，而是JNK信号通路持续激活引起JNK应答基因表达增强。Smurf1可靶向JNK的上游激活因子MAPK/ERK激酶激酶2(MAPK/ERK kinase kinase 2，MEKK2)，介导其泛素化降解，表明MEKK2下调是Smurf1基因敲除小鼠产生相应表型的主要原因。Smurf1-/-乳鼠颅骨原代成骨样细胞磷酸化的MEKK2含量增加伴有下游JNK信号级联激活，而过表达Smurf1显著增加MEKK2泛素化和降解，证实MEKK2是Smurf1在成骨细胞中重要的底物蛋白。此后的研究还进一步发现在前成骨细胞或成熟成骨细胞阶段，Smurf1主要通过介导MEKK2的泛素化和降解调节骨形成，而在MSCs定向分化前，Smurf1则通过泛素化降解途径调节JunB蛋白水平负向调控MSCs增生和分化。JunB属于c-Jun蛋白家族成员，而c-Jun蛋白家族和c-fos蛋白家族共同构成AP-1转录因子，调节成骨细胞的分化。对Smurf1-/-小鼠的骨髓间充质前体细胞的分析显示JunB蛋白水平升高，进一步分子实验证实Smurf1可特异性识别JunB的PY motif并发生相互作用，进而介导JunB蛋白的泛素化和降解。该研究表明除了Smad依赖通路中的Runx2和Smad1/5是Smurf1底物，Smurf1作为E3连接酶还可介导非Smad依赖途径中的MEKK2和JunB的降解，通过抑制JNK、p38 MAPK活性，负向调控成骨细胞功能。至于Smurf1基因失活并没有导致BMP信号通路的抑制效应，可能是因为Smurf2的代偿作用。Smurf1基因敲除小鼠可表现为Smurf2活性增强，Smurf1/Smurf2双敲小鼠则表现为胚胎致死，提示Smurf1和Smurf2具有重叠和补偿功能。

除了Smurf1，其他HECT类E3连接酶成员Wwp1和Itch也可靶向JunB参与成骨作用的调控。Wwp1可介导JunB的泛素化和降解，但需要在TNF诱导的条件下。相关研究显示TNF转基因小鼠MSCs成骨分化显著降低，而Wwp1表达升高，抑制Wwp-1表达可逆转TNF-Tg小鼠MSCs的成骨分化障碍。E3连接酶Itch可靶向并促进JunB蛋白降解，而抑制成骨细胞的分化，而Itch基因敲除小鼠骨容量和骨形成速率均显著增高。

Smurf1的E3连接酶活性受多种因素调节。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可诱导Smurf1表达促进Runx2降解。Smurf1通过促进Smad1和Runx2蛋白泛素化和蛋白酶体降解参与TNF转基因慢性炎性关节炎模型小鼠全身性骨丢失的发病。敲除Smurf1可减少TNF介导的成骨细胞Smad1/5和Runx2蛋白水平下降，减轻全身骨丢失。酪蛋白激酶2相互作用蛋白-1(caseine-kinase 2 interacting protein-1，CKIP-1，also known as Plekho1)是发现的第1个Smurf1的辅助增强因子。CKIP-1特异性靶向Smurf1分子WW结构域的连接区，通过改变Smurf1的空间构象结构，从而增加其与底物的亲和力，促进其底物蛋白的泛素化降解，抑制成骨细胞的增生、分化及成骨功能。抑制骨质疏松模型大鼠的CKIP-1基因表达可增强成骨细胞分化和骨形成，并在一定程度上逆转骨质疏松，进一步确立Smurf1在骨生成中的重要作用。Smurf1自身的稳定性也可被其他E3连接酶调控。FBXL家族的F-box蛋白FBXL15形成的SCFFBXL15复合体可介导Smurf1的泛素化降解，并通过此方式在BMP通路调控的胚胎发育及成体骨稳态中发挥重要的作用。还有研究发现Cdh1可通过降低Smurf1同源二聚体的自抑制效应增强Smurf1的活性，敲除Cdh1可导致Smurf1活性及其下游信号通路(包括MEKK2信号通路)细胞效应降低，影响成骨细胞分化。

E3连接酶在Wnt/β-catenin信号通路中的作用

Wnt信号可通过刺激成骨细胞发育促进骨形成，体外实验表明Wnt/β-catenin信号(即经典Wnt信号通路)在这一过程中起到关键作用。经典Wnt/β-catenin信号通过促进干细胞再生、细胞增殖，诱导成骨分化，抑制成骨细胞和骨细胞凋亡等机制增加成骨作用及骨形成。当信号细胞释放的或位于信号细胞表面的Wnt蛋白与靶细胞表面的卷曲蛋白/低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(frizzled/low density lipoprotein receptor related protein5/6，FZD/ LRP5/6)复合体结合，通过散乱蛋白(dishevelled，Dvl)抑制由大肠腺瘤样蛋白(adenomatous polyposis col，APC)、轴蛋白(Axin)、糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)及酪蛋白激酶(casein kinase 1，CK1)构成的复合体形成，GSK3β活性受抑制，继而其底物β-catenin的磷酸化及降解减少。在细胞内聚集的β-catenin进入核内与转录因子细胞因子/淋巴增强因子(transcription factor cytokines/Lymphatic enhancement factors，TCF/LEF)相互作用促进下游成骨基因的表达。骨硬化蛋白(sclerostin，SOST)和Dickkopf(DKK)可抑制Wnt信号和LRP5/6共受体活性，导致骨量减少。

经典Wnt信号通路中的β-catenin参与细胞的增生、分化和凋亡的调节和基因的表达，在软骨形成和成骨细胞功能的调控中发挥重要作用。β-catenin水平增高可显著增强骨形成并伴有成骨细胞特异性基因的表达增加，而条件敲除的β-catenin基因可导致早期发育阶段异位软骨形成和成骨细胞分化异常。蛋白酶抑制剂硼替佐米可直接作用于Wnt /β-catenin信号通路，增加成骨细胞中β-catenin累积促进成骨细胞的增生、分化和存活。而这些效应就是通过抑制β-catenin的降解而实现增强成骨作用和骨形成。RING类E3连接酶SCFβ-TrCP参与Wnt信号通路的调节，介导β-catenin经泛素/蛋白酶体途径发生降解，是成骨细胞分化的重要调节因子。BMP-2与β-catenin可协同促进成骨细胞分化，研究发现BMP-2可促进LRP5基因表达并抑制可特异性识别β-catenin的E3连接酶SCFβ-TrCP的表达，减少β-catenin的泛素化降解，促进成骨细胞增生和分化。

E3连接酶在Hedgehog信号通路中的作用

Hedgehog信号通路参与骨形成的调节。Hh与细胞表面受体Patched(Ptc)结合解除Ptc对Smoothened(Smo)的抑制作用。活化的Smo激活并稳定转录因子Gli2，介导Gli1和其他Hh靶基因的转录。Hedgehog信号通路在早期骨形成中必不可少，参与Runx2，Osterix和碱性磷酸酶等骨形成蛋白的调控，协同BMP2信号调控成骨细胞的分化及增生，其中转录因子Gli2在Hh信号转导中发挥关键作用，介导BMP-2的表达，促进成骨作用。研究表明蛋白酶体抑制剂可直接作用于Hedgehog信号通路，减少“锌指结构”转录因子Gli2的降解，提示泛素-蛋白酶体系统介导Gli的降解，进一步研究表明E3连接酶SCFβ-TrCP可特异性识别Gli2并介导其泛素化降解，从而抑制BMP-2的表达和骨形成，而通过抑制微管聚集可减少SCFβ-TrCP对Gli2的泛素化降解促进BMP-2的表达和骨形成。

E3连接酶在FGF信号通路中的作用

成纤维细胞生长因子家族是一类分泌型蛋白，可结合并活化酪氨酸激酶型受体，激活细胞内下游Ras、丝裂原活化蛋白激酶、3-磷脂酰肌醇激酶/苏氨酸激酶、蛋白激酶C等信号分子及下游靶基因，调节胚胎发育和多种细胞生理活动，尤其对骨骼发育具有重要的调节作用，是软骨内成骨和膜内成骨的关键调控因素。研究表明E3连接酶Cbl在受体酪氨酸激酶部位的聚集和诱导的多种受体酪氨酸激酶的多聚泛素化和降解是成骨细胞功能重要的调控机制之一。Cbl可介导血小板源性生长因子受体-α(platelet-derived growth factor receptor-α, PDGFR-α)和成纤维细胞生长因子受体-2(fibroblast growth factor receptor-2, FGFR-2)的泛素化降解，从而抑制hMSCs的定向成骨分化，突变Cbl蛋白增加PDGFR-α和FGFR-2表达从而激活ERK1/2和PI3K信号通路，促进MSCs成骨细胞标志物的表达和成骨分化，而通过药物抑制FGFR或PDGFR可抵消突变Cbl产生的体外成骨诱导效应。

E3连接酶在PTH信号通路中的作用

甲状旁腺素(parathyroid hormone, PTH)结合并活化甲状旁腺激素受体1(parathyroid horm-one 1 receptor，PTH1R)激活下游效应分子调控成骨细胞。体外间歇性给予PTH处理刺激促进成骨细胞的成骨能力，但是持续给予PTH处理则产生抑制效应(经由PKA、PKC和Ca2+信号转导)。“间歇式”给予PTH对成骨细胞产生的效应是临床治疗骨质疏松的理论基础。研究表明间歇性给予PTH处理抑制转录因子ATF4的降解并促进成骨细胞分化和骨形成；而连续给予PTH处理则抑制Runx2诱导的骨形成。间歇性给予PTH治疗通过减少E3连接酶SCFβ-TrCP介导的ATF4降解而增加ATF4的蛋白水平，从而增加骨形成。研究表明SCFβ-TrCP与转录因子ATF4共定位于细胞核，并参与ATF4稳定性的调节。E3连接酶SCFβ-TrCP可特异性识别底物蛋白中的DSG(X)2+nS基序，当ATF4位于DSGXXXS基序中219位丝氨酸残基磷酸化后即可被β-TrCP识别。β-TrCP可诱导细胞中的ATF4泛素化及降解，反之敲除β-TrCP蛋白可抑制ATF4的泛素化降解。持续给予PTH增加Smurf1表达，导致Runx2降解增加和成骨细胞抗凋亡信号衰减，表明Smurf1也介导PTH对成骨细胞的调节。还有一些研究表明蛋白酶体可介导PTH前体甲状旁腺素原的降解，但PTH或其前体的特异性E3连接酶尚未确定。

E3连接酶与生长激素

生长激素(growth hormone，GH)和胰岛素样生长因子-1 (insulin-like growth factor-1，IGF-1)参与骨量的维持。GH促进成骨细胞和破骨细胞的活性增加骨转换。细胞表面的GH受体(growth hormone receptor, GHR)受泛素化-蛋白酶体降解系统调节，研究表明E3连接酶SCFβ-TrCP介导GHR的细胞内吞作用和蛋白降解。IGF-1可通过与成骨细胞表面受体相互作用促进骨生长，参与调控成骨细胞分化。E3连接酶Cbl-b可通过泛素化-蛋白酶体降解胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)抑制IGF-1信号。近年来的研究发现在正常和病理条件下，Cbl可介导成骨细胞功能调节蛋白的降解。去除后肢神经支配的小鼠股骨IRS-1、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(Akt-1)蛋白表达降低，骨形成减少，而Cbl基因敲除小鼠并没有出现与野生型小鼠类似的骨形成减少。分子生物学及细胞学研究证实Cbl通过介导IRS-1的泛素化降解减少IGF-1信号对成骨细胞促有丝分裂效应，导致骨形成减少。

E3连接酶与PI3Ks

PI3Ks蛋白家族参与细胞增生、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。近年来研究发现PI3K在成骨细胞增生和分化中也起到重要作用。应用成骨细胞和小鼠模型研究发现E3连接酶Cbl可与PI3K相互作用，诱导PI3K的泛素化降解从而抑制成骨细胞增生促进凋亡，相反抑制Cbl与PI3K的相互作用可促进成骨细胞的增生和分化，增强成骨作用及骨容量。例如从Saethre-Chotzen综合征患者颅骨提取的原代成骨样细胞E3连接酶Cbl表达下调，Cbl介导的PI3K泛素化降解减少，PI3K蛋白累积增加，促进PI3K/Akt信号依赖的成骨细胞增生及分化，造成颅缝过早融合。

E3连接酶与整合素

整合素在成骨细胞分化和骨形成中发挥重要的作用。跨膜蛋白整合素在细胞间相互作用中发挥黏附分子的作用，同时有助于细胞黏附骨基质蛋白。整合素介导机械力学信号转导影响成骨细胞功能和骨形成。抑制整合素α5β1可引起成骨细胞活性降低导致骨形成减少。整合素α4β1有促进间充质干细胞向骨组织的归巢作用，整合素β1亚基可被蛋白酶体降解，而IGF-1/IGF-1R复合体可稳定其水平。E3连接酶c-Cbl可通过介导整合素α5亚基的蛋白酶体降解引起整合素表达下调，通过降低成骨细胞的黏附和促进凋亡而调节成骨细胞分化和骨形成。

E3连接酶与其他成骨调节蛋白

红系衍生的核因子2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related facter-2，Nrf2)通过调节抗氧化酶在骨的氧化应激效应中发挥关键作用，基于Nrf2基因敲除小鼠的研究发现Nrf2主要以抑制成骨细胞功能为主。细胞中Nrf2水平主要通过蛋白酶体降解调节，E3连接酶Keap1-Cul3-Rbx1复合体和SCFβ-TrCP靶向泛素化并通过蛋白酶体降解Nrf2，而蛋白酶抑制剂则可增加细胞质Nrf2蛋白水平。

昼夜节律也可影响骨代谢，Maronde的研究发现昼夜节律蛋白2(period2，PER2)和隐花色素2(cryptochrome 2，CRY2)主要作用于成骨细胞，成骨细胞Per2基因缺失表现为骨量增加，研究发现E3连接酶SCFβ-TrCP和Fbxl3可分别与PER2和CRY2发生特异性相互作用，但该相互作用是否对成骨细胞产生影响还不清楚。

泛素-蛋白酶体系可特异性识别并降解信号蛋白、转录因子等底物蛋白，在维持骨代谢动态平衡、促进骨重建和预防骨代谢疾病中发挥重要的作用。近年来，泛素-蛋白酶体系统在调节骨组织细胞功能方面的临床研究取得了巨大的进展，相关临床研究发现蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib，BZB)可促进多发性骨髓瘤患者的成骨作用并抑制骨吸收，进一步研究证实硼替佐米可通过减少Runx2的蛋白酶体降解促进MSCs的成骨定向分化促进骨形成，还可通过减少胞外Wnt /β-catenin信号通路拮抗剂Dickkopf1(DKK1)的表达促进骨形成。蛋白酶体抑制剂乳胞素(lactacystin)也可促进成骨细胞的分化。越来越多的临床研究证实泛素-蛋白酶体系统在骨形成调控中发挥重要的作用，具有广阔的开发应用及成药前景。

Smurf1、SCFβ-TrCP、Cbl等E3连接酶通过介导调控成骨细胞增生和分化的转录因子和信号通路中的重要蛋白的降解参与骨形成调节，在成骨细胞分化中起关键作用，深入了解两者之间相互作用的方式、信号通路及分子机制，有助于对以成骨细胞功能异常和骨形成缺陷为主的骨代谢疾病治疗策略的制定和精准化靶向治疗的研发，以期达到促进骨细胞的分化和功能，减少骨丢失，预防和缓解骨质疏松症的发生和进展的目的。但需要警惕的是由于E3连接酶底物蛋白众多，靶向治疗也有可能同时带来意想不到的有害效应，还需要进一步的深入研究探索。