作者：

陈秀鹃^1,2 孙琳² 张正军² 李懂² 宋敏² 王娜² 张波² 梁秋华²

单位：

1. 济宁医学院研究生处

2. 济宁医学院附属医院内分泌科

摘要：目的  观察长链非编码RNA-抗分化非编码RNA（anti-differentiation non-coding RNA，ANCR）对动脉钙化细胞模型的影响，探讨其可能的作用机制。方法  以10 mmol/L β-甘油磷酸钠（beta-glycerophosphate，β-GP）诱导小鼠血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）成骨样分化以建立动脉钙化细胞模型，构建ANCR过表达慢病毒载体并感染小鼠VSMCs，qPCR检测Runt相关转录因子2（Runt related transcription factor 2，Runx2），骨形成蛋白-2（bone morphology protein-2，BMP-2）和ANCR的表达，Western blot检测胞质蛋白Runx2、BMP-2及核内核转录因子-Kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）p65的表达，茜素红染色观察矿化结节的形成。结果  （1）β-GP刺激后小鼠VSMCs中Runx2和BMP-2的表达显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05），茜素红染色可见明显的矿化结节。（2）β-GP刺激后小鼠VSMCs中ANCR的表达显著降低，Runx2和BMP-2的mRNA表达显著增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。（3）ANCR过表达慢病毒感染后与对照组相比，Runx2和BMP-2的mRNA水平和蛋白水平均显著下降，NF-κBp65的蛋白表达显著降低，钙化结节形成显著减少，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论  ANCR能抑制Runx2和BMP-2的表达，且可能通过削弱NF-κB信号通路抑制β-GP诱导的小鼠VSMCs成骨样分化。

关键词：动脉钙化；血管平滑肌细胞；成骨样分化；长链非编码RNA；核转录因子-kappa B；

动脉钙化是普遍存在于冠心病、糖尿病、慢性肾脏疾病等疾病中的病理现象，其细胞学基础是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的成骨样分化。研究表明，在动脉钙化的过程中，VSMCs分泌大量的骨相关蛋白如碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨钙素(osteocalcin，OCN)、Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2，Runx2) 和骨形成蛋白-2(bone morphology protein-2，BMP-2) 等而具有成骨细胞的表型，其确切的机制尚不完全明确。动脉钙化是急性心肌梗死、脑梗死、截肢等发生的独立危险因素。因此，研究动脉钙化的治疗和干预措施具有重要意义。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，IncRNA)是近年来发现的、长度超过200个碱基的RNA，该类RNA不编码蛋白，但能够在转录及转录后水平调节蛋白编码基因的表达。研究表明，IncRNA在生长发育、细胞定向分化、亚细胞结构分布、进化选择等方面发挥了重要的调控作用。抗分化非编码RNA(anti-differentiation non-coding RNA，ANCR)是一种包含855个碱基的IncRNA。Kretz等发现ANCR的表达缺失可诱导表皮细胞中分化相关基因的大量表达，从而导致表皮细胞的分化。Zhu等发现ANCR在人成骨细胞分化时的表达显著下降，ANCR可通过募集增强子zeste homolog 2而抑制Runx2的表达，最终抑制人骨细胞的分化。Jia等发现，下调ANCR的表达可以促进牙髓组织干细胞向成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞分化。基于以上的研究，可以认为ANCR具有抑制细胞分化的作用。那么ANCR是否也可以影响VSMCs成骨样分化的过程，目前尚不清楚。本研究利用β-GP干预小鼠VSMCs建立动脉钙化的细胞模型，构建ANCR过表达慢病毒载体并感染小鼠VSMCs，探讨ANCR过表达对VSMCs成骨样分化的抑制作用。

材料和方法

细胞与主要试剂

小鼠原代VSMCs购于江苏齐氏生物科技有限公司，转染增强剂Polybrene和Ehanced Infecction Solution均购于上海吉凯基因化学技术有限公司，β-GP、茜素红染料均购于美国Sigma公司，胎牛血清(fatal bovine serum，FBS)、DMEM/F12(1：1) 培养基均购于美国Gibco公司，青霉素-链霉素购于美国Genview公司，0.25%胰酶(含EDTA)购于美国Gibco公司，6孔板、细胞培养瓶均购于美国Labserve公司，All-in-One^® First-Strand cDNA合成试剂盒和All-in-One^® qPCR试剂盒均购于广州复能基因有限公司，小鼠抗小鼠Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2，Runx2)、骨形成蛋白-2(bone morphology protein-2，BMP-2)，核转录因子-kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB) p65抗体均购于美国Abcam公司，HRP标记的山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司，小鼠β-actin、Runx2、BMP-2、ANCR引物(引物序列见表1)均购于生工生物工程(上海)股份有限公司，胞质及核蛋白提取试剂盒购于江苏碧云天生物技术有限公司，ECL化学发光液购于美国Millipore公司。

方法

动脉钙化细胞模型的建立：参照笔者以往的研究，应用10 mmol/L β-GP干预小鼠的VSMCs建立动脉钙化的细胞模型。小鼠原代VSMCs按5×10⁵/孔接种到6孔板中，加入DMEM/F12(1：1) 完全培养基(含L-谷酰胺、10% FBS、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素)进行培养，给予10 mmol/L β-GP作为干预。分别在培养第3、6、9、12天收集细胞，qPCR检测Runx2和BMP-2的表达，以验证动脉钙化的细胞模型构建成功；同时qPCR检测ANCR的表达。

慢病毒感染：ANCR过表达慢病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司构建，过程简要如下：ANCR过表达的质粒和病毒包装辅助质粒共转染293T细胞，收集细胞上清，收获病毒，离心浓缩，去除杂质，将病毒浓缩与纯化，得到浓度为5×10⁸ TU/mL的慢病毒。得到慢病毒后，将小鼠VSMCs以5×10⁵/孔接种到6孔板中，每孔加入2 mL的DMEM/F12(1：1) 完全培养基进行培养。参照预实验的结果，设定MOI值为100。VSMCs接种12 h后，以Eri.S+5 μg/mL Polybrene为感染条件进行感染，分为2组：阴性病毒组、阳性病毒组，每组设3个平行，48~72 h后观察荧光与细胞状态(图1)。qPCR检测阴性病毒组和阳性病毒组ANCR的表达情况，以证明感染有效。将实验分为4组，空白组、β-GP组、阴性病毒+β-GP组、阳性病毒+β-GP组，按照相应的组别将不同的细胞按照5×10⁵/孔接种到6孔板中，DMEM/F12(1：1) 完全培养基培养，12 h后，空白组继续DMEM/F12(1：1) 完全培养基培养，β-GP组、阴性病毒+β-GP组、阳性病毒+β-GP组分别在DMEM/F12(1：1) 完全培养基的基础上给予10 mmol/L β-GP干预。干预96 h后收集细胞，qPCR检测Runx2和BMP-2 mRNA的表达，Western blot法检测Runx2、BMP-2和NF-κB p65蛋白的表达；干预21 d后，茜素红染色观察矿化结节的形成。

qPCR：使用Trizol(Life Technology，美国)提取细胞总RNA，取1 μg总RNA，利用All-in-One^® First-Strand cDNA合成试剂盒，以25 μL的体系进行反转录，获得相应的cDNA。配制20 μL的实时定量PCR反应体系，每反应管加入cDNA模版2 μL、2×All-in-One^® qPCR Mix 10 μL和ROX Reference Dye 0.2 μL，引物终浓度0.2 μmol/L。PCR循环反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，40个循环。Ct值为每个反应管内荧光信号到达设定域值所经历的循环数，用2^-△△Ct法计算基因的相对表达水平。

Western blot法检测：待VSMCs干预完毕后，弃去6孔板中的完全培养基，室温下PBS冲洗两次，加入适当体积的胞质/核蛋白提取裂解液(含蛋白酶抑制剂)，冰上静置20~30 min(中间间断混匀几次)，收集细胞悬液，4 ℃，12 000 r/min，5 min，收集上清于EP管中，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白样品的浓度，根据测定的样品的浓度，计算各样品中的总蛋白量，并向各样品中加入相应体积5×loading bufffer混匀，在100 ℃下变性5 min，统一各样品的浓度，-80 ℃保存备用。取20 μg变性蛋白，经10% SDS-PAGE电泳分离后，转印到0.2 μm的PVDF膜上；室温下5%的脱脂奶粉中封闭1 h，用PBS-T(含0.1%的TWEEN-20) 洗涤3次，加入稀释的小鼠抗小鼠Runx2(1：500)、小鼠抗小鼠BMP-2(1：500) 和兔抗小鼠NF-κB p65(1：400) 一抗，4 ℃孵育过夜；PBS-T洗涤3次，分别加入1：2 000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔的二抗，室温摇床孵育1 h，PBS-T洗3次，PBS洗1次，加入ECL化学发光液(A液：B液=1：1)，胶片曝光适当时间后显影、定影，观察条带。

茜素红染色：干预结束后PBS洗涤3遍，使用95%乙醇常温固定10 min，再次用PBS洗涤3遍，加入1%的茜素红，37 ℃温箱孵育1 h，PBS洗涤3遍，显微镜下观察矿化结节的形成，Image J软件进行分析。

统计学方法

实验数据用均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 20.0统计软件统计处理，组间比较应用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

β-GP刺激VSMCs后对Runx2、BMP-2和ANCR mRNA表达的影响

qPCR结果显示，与空白组相比，在干预第3、6、9及12天，β-GP组Runx2和BMP-2 mRNA水平均显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；ANCR mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)(图2)。

ANCR过表达慢病毒感染VSMCs后对Runx2、BMP-2和ANCR mRNA表达的影响

qPCR结果显示，阴性病毒组和空白组相比，ANCR的表达差异无统计学意义(P＞0.05)；与空白组和阴性病毒组相比，阳性病毒组ANCR的表达显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，证明感染有效(图3)。与空白组相比，β-GP组、阴性病毒+β-GP组Runx2、BMP-2 mRNA显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与β-GP组相比，阴性病毒+β-GP组Runx2、BMP-2 mRNA水平差异无统计学意义(P＞0.05)；与β-GP组和阴性病毒+β-GP组相比，阳性病毒+β-GP组Runx2、BMP-2 mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)(图4)。

ANCR过表达慢病毒感染VSMCs后对矿化结节形成的影响

β-GP刺激VSMCs后，能形成明显的矿化结节。而ANCR过表达慢病毒感染VSMCs后，与空白组相比，β-GP组、阴性病毒+β-GP组有典型的钙化结节形成，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与β-GP组、阴性病毒+β-GP组相比，阳性病毒+β-GP钙化结节的形成显著减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)(图5)。

ANCR对VSMCs中NF-κB信号通路的影响

Western blot检测结果显示, 与空白组相比较，β-GP组和阴性病毒+β-GP组Runx2、BMP-2和NF-κB p65的蛋白水平表达显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与β-GP组、阴性病毒+β-GP组相比，阳性病毒+β-GP组Runx2、BMP-2和NF-κB p65的蛋白水平表达显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)(图6)。

讨论

传统观点认为动脉钙化是“被动的”磷酸钙结晶沉积，是机体衰老的一种表现；而现在的研究表明，动脉钙化是类似于骨形成的一种主动调节过程，它受一些激素和细胞因子的调控。本研究首次证明lncRNA-ANCR在动脉钙化中发挥了重要的负性调控作用。

动脉钙化的发生是VSMCs进行成骨样分化的过程。在此过程中，VSMCs中Runx2、BMP-2、细胞核因子-κB受体活化因子配基(RANKL)、ALP、OCN等成骨细胞标志性分子的表达显著升高，并形成类似于成骨过程中的基质小泡，聚集钙离子，形成钙化中心，进而形成钙化结节。在本研究中，β-GP刺激后的小鼠VSMCs中Runx2、BMP-2的表达显著升高并伴有矿化结节的形成，证明动脉钙化的细胞模型建立成功。为了探讨ANCR是否参与了动脉钙化的发病过程，以β-GP刺激VSMCs，分别在3、6、9、12 d检测ANCR的表达，结果显示ANCR在上述不同时间点的表达较对照组均显著下降，提示ANCR与动脉钙化的发病有关。为了进一步明确ANCR在动脉钙化中的作用，构建了ANCR过表达慢病毒并感染了小鼠VSMCs，qPCR的结果显示，阳性病毒感染后的小鼠VSMCs中ANCR的表达是显著升高的，证明ANCR过表达慢病毒感染有效。进一步的qPCR和Western blot均证明，ANCR过表达可显著降低β-GP刺激的小鼠VSMCs中Runx2、BMP-2的表达，提示ANCR可抑制VSMCs的成骨样分化；进一步的茜素红染色证明了ANCR过表达可显著抑制β-GP刺激的小鼠VSMCs中矿化结节的形成。本研究结果证明，ANCR是动脉钙化发生过程中的关键性抑制因子。

NF-κB是Rel家族的转录因子，哺乳动物细胞中有5种NF-κBRel：RelA(P65)、RelB、C-Rel、P50、P52，它们通过形成同源或异源二聚体以启动不同的基因转录。NF-κB参与了包括炎症、脂质代谢、肿瘤、自身免疫等多种疾病的发生、发展过程。目前已经证实，NF-κB与动脉钙化的发生密切相关，抑制NF-κB信号通路可削弱动脉钙化的进程。最常见的NF-κB是由p50和p65组成的异源二聚体，在静息状态下NF-κB在胞质中存在，当受到刺激因子活化后NF-κB的p65亚基会发生核内转位，因此细胞核内NF-κB p65的表达水平是反映NF-κB信号通路活化水平的重要标志。NF-κB复合物进入核内，并参与增殖、凋亡和血管生成相关的基因的表达并激活其转录。本研究为了探讨ANCR调控VSMCs成骨样分化的可能机制，检测了ANCR过表达的VSMCs核内NF-κB p65的表达。结果显示，ANCR过表达可以显著减少β-GP刺激后的小鼠VSMCs中NF-κB的活化水平。本研究结果显示：ANCR过表达的小鼠VSMCs中NF-κB的活化水平下降伴随着Runx2和BMP-2表达的下降，同时ANCR过表达的小鼠VSMCs中矿化结节显著减少。本研究结果提示：ANCR通过抑制NF-κB的活化水平而降低小鼠VSMCs中Runx2和BMP-2的表达并最终抑制小鼠VSMCs的成骨样分化。Feng等研究发现，TNF-α可以通过NF-κB信号通路上调Runx2和BMP-2的表达而促进人牙髓干细胞的成骨样分化。本研究结果与该研究发现一致，即NF-κB调控Runx2和BMP-2的表达是成骨样分化这一进程中的重要事件。然而，Hou等利用大鼠VSMCs建立动脉钙化细胞模型，发现姜黄素抑制VSMCs成骨样分化的作用与NF-κB信号通路无关。笔者认为产生这一差异的原因有两个：(1) 不同种属间成骨样分化调控的具体机制可能不同；(2) 在小鼠VSMCs成骨样分化的过程中，Runx2和BMP-2可能受多个信号通路的调控，ANCR过表达可通过抑制NF-κB的活化而下调Runx2和BMP-2的表达。其具体的分子机制尚需进一步研究。

综上所述，本研究成功构建了动脉钙化细胞模型并证明ANCR可能是动脉钙化中的关键性负性调节因子；ANCR可能通过削弱NF-κB信号通路抑制β-GP刺激的小鼠VSMCs成骨样分化，但是ANCR抑制NF-κB的具体机制仍不明确。ANCR能否作为治疗动脉钙化的新靶点，尚需进一步的研究。