作者：袁晔¹ 易剑桥^1# 徐非² 王亮¹ 杨帆³ 张辉¹  徐又佳¹

单位：

1. 苏州大学附属第二医院骨科

2. 苏州大学唐仲英医学研究院血液学研究中心

3. 苏州大学骨质疏松症诊疗技术研究所

摘要：目的  了解铁蓄积雄性小鼠骨量变化及降铁剂去铁胺（deferoxamine，DFO）干预后骨量改变。方法  在体实验，选取18只6~8周C57雄性小鼠分为对照组（Ctrl组）、铁蓄积组（FAC组）、DFO干预组（FAC+DFO组），铁蓄积组使用枸橼酸铁铵（ferric ammonium citrate，FAC）干预8周（每周0.1 g/kg），DFO干预组在制作铁蓄积组的第4周FAC注射后1h腹腔注射DFO每周0.2 g/kg。8周后各组均检测：血清铁蛋白（ferritin，FER）、股骨远端骨小梁三维形态重建和空间结构参数。体外实验：使用MC3T3细胞，分为对照组（Ctrl组）、铁蓄积组（FAC组）、DFO干预组（FAC+DFO组）；FAC组加FAC干预48 h，DFO组在FAC干预24 h时加入DFO；48 h后收集3组细胞，检测指标：细胞碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein 2，BMP2）表达。结果  micro-CT检测提示Ctrl组BMD（104.68±8.56）mg/m³，BV/TV（19.92±1.92）%，Tb.Th（0.098±0.008）mm，Tb.Sp（0.172±0.133）mm，ALP活性值0.71±0.06；FAC组BMD（50.41±10.27）mg/m³，BV/TV（10.18±1.76）%，Tb.Th（0.057±0.012）mm，Tb.Sp（0.322±0.214）mm，ALP活性值0.33±0.04；FAC+DFO组BMD（92.72±9.62）mg/m³，BV/TV（17.84±1.54）%，Tb.Th（0.085±0.010）mm，Tb.Sp（0.186±0.195）mm，ALP活性值0.59±0.03。FAC组相比于Ctrl组骨密度、骨小梁空间结构参数显著下降，成骨细胞ALP活性受抑制，BMP2表达与Ctrl组比较降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；DFO干预后骨密度恢复，骨小梁空间结构参数恢复正常，ALP和BMP2表达恢复正常，与FAC组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论  雄性小鼠铁蓄积后骨量显著下降，DFO干预可以缓解铁蓄积相关的骨量减低，其机制可能与DFO阻断铁蓄积对BMP2的抑制有关。

关键词：铁蓄积；小鼠,，雄性；骨质疏松；去铁胺；

许多病理状态铁过载疾病存在骨质疏松并发症，例如血红蛋白沉着病、含铁血黄素沉着症、地中海贫血、镰状细胞疾病；2006年Weinberg提出假说认为体内铁增加是骨质疏松症的危险因素。近年来，许多研究发现绝经后女性会出现铁蓄积，且铁蓄积与骨质疏松症显著相关。女性铁蓄积可能与雌激素减少相关，已有研究采用卵巢切除术 (ovariectomy，OVX) 动物模型，探讨雄性动物铁蓄积会不会骨量下降？降铁干预可否恢复骨量下降。目前这方面研究较少，本实验研究雄性铁蓄积小鼠模型骨量变化和降铁剂去铁胺 (deferoxamine，DFO) 对骨量变化的影响。

材料与方法

实验动物

体内实验使用SPF级8周雄性C57小鼠 (苏州大学实验动物中心)，实验动物许可证号：SYXK (苏)2014-0030，18只小鼠分为对照组、铁蓄积组、DFO干预组，每组6只。

铁蓄积 (FAC) 组：使用枸橼酸铁铵 (ferric ammonium citrate，FAC) 腹腔注射，剂量每周0.1 g/kg，共8周。

DFO干预 (FAC+DFO) 组：使用FAC腹腔注射，剂量每周0.1 g/kg，共8周，第4周FAC干预后1 h腹腔注射DFO，剂量每周0.2 g/kg。

对照 (Ctrl) 组：采用腹腔注射0.9%氯化钠注射液处理每周0.1 g/kg，共8周。8周后所有小鼠麻醉处死。

血清铁蛋白检测

各组小鼠相同条件饲养8周后处死并眼眶取血，酶联免疫吸附测定 (enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA) 法检测血清铁蛋白 (ferritin, FER, ABCam)，具体操作步骤按说明书进行。

骨量micro-CT评估

各组小鼠处死分离单侧股骨，使用micro-CT扫描，进行股骨远端骨小梁三维形态重建和空间结构参数分析，分析参数包括：骨密度 (bone mineral density，BMD)、骨体积分数 (bone volume/tissue volume，BV/TV)、骨小梁厚度 (trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分离度 (trabecular separation，Tb.Sp)。

细胞培养

MC3T3细胞 (中科院上海细胞库) 使用包含10% FBS (Gibco)、100 U/mL青霉素 (Beyotime)、100 μg/mL链霉素 (Beyotime) 的α-MEM (Hyclone) 培养基在5% CO₂、37 ℃环境培养，72 h后换液，培养3 d进行传代。

ALP活性检测

MC3T3细胞以每孔1×10⁵/mL密度接种于6孔板中。细胞24 h后贴壁加入50 mg/L抗坏血酸和10 mmol/L β甘油酸钠，FAC组培养基中加入FAC 100 μmol/L培养48 h，DFO干预组加FAC 100 μmol/L，第24小时加DFO 10 μmol/L，对照组加PBS 100 μmol/L 48 h。各组48 h后每孔加入75 μL Triton X-100裂解细胞，收集上清液后用BCA试剂盒 (Beyotime Biotichnology) 测定总蛋白浓度，用碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP) 活性测定试剂盒 (Labassay) 测ALP含量。使用酶标仪测定波长为520 nm各孔的吸光度并据此计算单位蛋白浓度中ALP的相对活性。

Western blotting法检测

MC3T3细胞经PBS清洗使用裂解液提取蛋白，BCA定量后取60 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，之后转移至PVDF膜，常规免疫染色[兔抗-骨形成蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)2，Boster；人抗-GAPDH，上海康成有限责任公司]，4 ℃过夜，TBST冲洗后二抗孵育1 h，DAB显色。

统计学方法

采用统计软件SPSS19.0进行统计，采用方差分析，实验数据以均数±标准差 (x±s) 表示。P < 0.05表示差异有统计学意义。

结果

血清铁蛋白水平

ELISA结果显示，FAC组与对照组相比，FAC组干预8周后FER水平明显上升；DFO干预组与FAC组相比，DFO能降低体内铁蓄积水平，差异具有统计学意义 (P < 0.05)(图1)。

股骨micro-CT结果

小鼠股骨远端micro-CT检测FAC组与对照组相比，FAC组干预8周后骨小梁结构破坏、骨小梁稀疏、连续性下降; DFO干预组与FAC组相比，DFO能缓解铁蓄积造成的骨量减低 (图2)；骨小梁空间结构参数显示：FAC组BMD、BV/TV、Tb.Th比对照组明显下降，Tb.Sp值增大，DFO干预组恢复正常，差异具有统计学意义 (P < 0.05)(表1)。

细胞ALP活性检测结果

对照组、FAC组、DFO干预组细胞ALP活性值分别为0.71±0.06、0.33±0.04、0.59±0.03，FAC组与对照组、DFO干预组与FAC组比较有统计学意义 (P < 0.05)(图3)。

Western blotting法检测结果

相比于对照组，FAC组细胞BMP2表达量降低，加入DFO后细胞BMP2表达量恢复正常 (图4)。

讨论

原发性骨质疏松症分为两型，Ⅰ型骨质疏松主要与雌激素减少相关，Ⅱ型骨质疏松主要与年龄相关。铁蓄积在Ⅰ型骨质疏松症的研究比较丰富，主要认为雌激素减少会导致女性月经排血停止造成铁蓄积 (正常女性1年可以通过月经排铁36 mg)。本研究在这一背景下，观察雄性小鼠 (排除雌激素影响) 增加外源性铁含量后骨量改变，并进一步观察降铁剂对铁蓄积雄性小鼠骨量改变的影响。

本实验在雄性小鼠中使用腹腔注射8周FAC制作铁蓄积模型，血清ELISA结果证实体内血清铁蛋白升高，micro-CT结果显示股骨远端骨量下降、骨小梁稀疏。这结果提示：雄性小鼠发生铁蓄积也可导致骨质疏松，该现象可能和活性氧簇 (reactive oxygen species，ROS) 升高有关。骨量下降有许多机制，其中BMP2是一种低分子量糖蛋白，与骨生成和再生有关，基因重组研究发现体内和体外BMP2表达能诱导骨的生成，BMP2抑制可以导致骨量下降。Shen等发现在Hepc1-/-铁调素缺乏铁蓄积小鼠模型中骨量下降、骨微结构破坏，BMP/SMAD通路受抑制。BMP2存在于骨基质中，对间充质干细胞 (mesenchymal stem cells，MSCs) MSCs有趋化和促进增生的作用，调节MSCs成骨分化。MC3T3细胞来源于MSCs，是成骨细胞前体细胞。本研究在细胞实验中铁蓄积可抑制成骨前体细胞BMP2表达，这提示，铁蓄积在雄性小鼠中可能影响成骨形成。

铁蓄积的临床干预主要是铁螯合剂使用。本实验在铁蓄积模型中，使用降铁药物DFO干预，micro-CT结果显示DFO可以抑制铁蓄积造成的骨量下降，同时血清铁蛋白水平降低；细胞实验提示：铁蓄积导致成骨细胞ALP活性下降，DFO干预后成骨细胞ALP活性恢复，Chen等在斑马鱼铁蓄积模型中使用DFO干预，结果提示DFO可以抑制铁蓄积诱发的骨量下降。已有实验证实DFO对雄性和雌性小鼠铁蓄积诱导骨量下降有抑制作用，本实验主要研究DFO对铁蓄积雄性小鼠骨量下降成骨指标ALP和BMP表达的影响。另外，MSCs与成骨细胞形成关系密切，在成骨过程中起重要作用，Najafi等研究发现DFO能促进MSCs归巢，与低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、趋化因子受体4(chemokine receptor4，CXCR4)、趋化因子受体 (CCR-2)、金属基质蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、金属基质蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9) 表达升高有关。Xie等研究提示铁蓄积可通过ROS抑制骨髓MSCs活性，使用DFO可以缓解；此外也有研究发现DFO可促进血管生成，抑制骨量降低。本实验表明铁蓄积可以抑制细胞活性，DFO干预可以缓解铁蓄积相关的骨量下降。

综上所述，雄性小鼠铁蓄积模型骨量下降，DFO能降低体内铁蓄积、缓解骨量丢失作用，可能与DFO阻断铁蓄积对成骨细胞ALP、BMP2的抑制有关。降低铁蓄积方法有可能成为铁蓄积骨质疏松治疗的补充干预新方法。